殼聚糖（Chitosan，CTS）是由甲殼素經脫乙?；瞥傻囊环N聚陽離子大分子天然多糖，其安全無毒，可生物降解，具有良好的生物相容性，無免疫原性，具有抑菌[2]、消炎、止血[3]、鎮(zhèn)痛[4]及促進傷口愈合等生物學功能。近年來國內外以殼聚糖為基礎原材料的生物醫(yī)用材料相關研究非常活躍，已成為多糖生物醫(yī)用材料研究的一個熱點。

殼聚糖主要來源于蝦蟹殼，在制備純化過程中雖然經強酸、濃堿反復處理[5]以除去大部分無機物和蛋白質等，但仍會有少量的蛋白質殘留，因此殼聚糖及其衍生物應用于生物材料方面，檢測控制其中的微量蛋白質含量對材料的安全性是非常必要的。

Folin-酚試劑法（Lowry法）和考馬斯亮藍法（Bradford法）是測定微量蛋白質常用的方法，靈敏度高，操作方便，應用廣泛[1]。在測定殼聚糖及其帶聚陽離子電荷的衍生物中的蛋白質含量時，Lowry法反應條件是在堿性和中性條件下進行，由于殼聚糖的水不溶性，殼聚糖衍生物如羧甲基殼聚糖（Carboxymethyl Chitosan，CM-CTS）、羥丙基殼聚糖（Chydroxypropyl Chitosan，HP-CTS）、羥乙基殼聚糖（Hydroxyethyl Chitosan，HE-CTS）等在偏堿性和中性pH條件下所帶的-NH2/-NH3+可與Lowry試劑中的Cu2+離子結合而形成大量的絮狀沉淀，故該法不適用于殼聚糖及其衍生物中蛋白質含量測定；Bradford法是在酸性條件進行的，所以殼聚糖以及殼聚糖衍生物如羧甲基殼聚糖、羥丙基殼聚糖、羥乙基殼聚糖等均可在此條件下進行蛋白質含量測定。但Bradford法試劑中含有多價負電荷的磷酸，能與殼聚糖及殼聚糖衍生物中的-NH2/-NH3+產生不溶性絮狀沉淀，干擾了考馬斯亮藍試劑測定這類多糖中蛋白質含量的準確性，導致測定結果偏高。在大量實驗研究的基礎上，對Bradford法中的試劑進行了改良，將試劑中的磷酸改為鹽酸。通過方法學驗證，結果表明改良后的考馬斯亮藍試劑用于測定殼聚糖及其衍生物中可溶性蛋白含量，方法靈敏，結果準確可靠，操作方便，是一種適合于殼聚糖及其衍生物中微量蛋白含量測定的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250，Sigma公司產品；殼聚糖（CTS）、羧甲基殼聚糖（CM-CTS）、羥丙基殼聚糖（HP-CTS），由青島博益特生物材料有限公司制備并純化；其他試劑均為國產商品試劑分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1800s紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；AL-104電子精密天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 試劑配制

（1）標準蛋白質溶液。準確稱取干燥至恒重的牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）50.0 mg，置100 mL容量瓶中，加水至刻度定容，配制成500 μg·mL-1的蛋白質標準溶液。準確量取該標準蛋白質溶液20 mL，置100 mL容量瓶中，加水至刻度定容，配制成100 μg·mL-1的蛋白質標準溶液。臨用前配制，4 ℃放置。

（2）殼聚糖樣品溶液。準確稱取干燥至恒重的殼聚糖0.5 g，置50 mL容量瓶中，加水充分懸浮，加冰乙酸0.5 mL振搖充分溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，配制成10 mg·mL-1的溶液，4 ℃下保存，一周內使用。

（3）羧甲基殼聚糖樣品溶液。準確稱取干燥至恒重的羧甲基殼聚糖0.5 g，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成10 mg·mL-1的溶液，4 ℃下保存，一周內使用。

（4）羥丙基殼聚糖樣品溶液。準確稱取干燥至恒重的羥丙基殼聚糖0.5 g，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成10 mg·mL-1的溶液，4 ℃下保存，一周內使用。

（5）經典考馬斯亮藍G-250試劑。稱取100 mg考馬斯亮藍G-250，溶于50 mL 95%的乙醇中后，再加入100 mL 85%的磷酸，用水稀釋到1 000 mL，過濾后備用。

（6）改良考馬斯亮藍G-250試劑。稱取100 mg考馬斯亮藍G-250，溶于50 mL 95%的乙醇中后，再加入50 mL濃鹽酸，用水稀釋到1 000 mL，放置過夜，過濾后備用。

1.3.2 經典考馬斯亮藍試劑測定殼聚糖及其衍生物的蛋白質含量的方法

在潔凈試管中分別依次加入不同量的標準蛋白質溶液，用水補足至1.0 mL進行標準蛋白標準曲線的測定，標準曲線的取樣點應不低于5個；另取一個試管中加水1.0 mL作為空白對照；另取潔凈試管加入樣品溶液1.0 mL，平行樣品應不少于3個；各加入考馬斯亮藍試劑5.0 mL，每管加畢后立即在旋渦混合器上混勻。混勻放置10 min后，在紫外可見光分光光度計上595 nm處測定相應光吸收值，以加水管為空白對照。以標準蛋白質濃度（μg·mL-1）為橫坐標，相應蛋白標準品對應管吸光值A595nm為縱坐標，作圖，即得蛋白質含量測定的標準曲線，按標準曲線計算樣品的蛋白質含量。

1.3.3 改良考馬斯亮藍試劑測定殼聚糖及其衍生物的蛋白質含量的方法

在潔凈試管中分別依次加入不同量的標準蛋白質溶液，用水補足至1.0 mL進行標準蛋白標準曲線的測定，標準曲線的取樣點應不低于5個；另取一個試管中加水1.0 mL作為空白對照；另取潔凈試管加入樣品溶液1.0 mL，平行樣品應不少于3個，各加入改良考馬斯亮藍試劑5.0 mL，每管加畢后立即在旋渦混合器上混勻。混勻放置10 min后，在紫外可見光分光光度計上（597±1）nm處測定相應光吸收值，以加水管為空白對照。以標準蛋白質濃度（μg·mL-1）為橫坐標，相應蛋白標準品對應管吸光值A595nm為縱坐標，作圖，即得蛋白質含量測定的標準曲線，按標準曲線計算樣品的蛋白質含量。

1.4 不同酸對考馬斯亮藍試劑pH值、顏色和最大光吸收值的影響

考馬斯亮藍染料G-250染料在酸性溶液中與蛋白質結合，染料的最大峰的位置發(fā)生變化，據此實驗采用了磷酸、冰醋酸、鹽酸，分別配制考馬斯亮藍試劑，考察不同酸對考馬斯亮藍試劑的pH值、溶液顏色及最大光吸收值的影響，用于考察不同酸配制的考馬斯亮藍試劑測定蛋白質含量的可行性。

1.5 考馬斯亮藍試劑測定蛋白質含量穩(wěn)定性考察

采用磷酸和鹽酸分別配制考馬斯亮藍試劑，對兩種試劑測定蛋白質的靈敏度和穩(wěn)定性進行考察。

1.6 改良考馬斯亮藍試劑測定蛋白質含量的線性范圍考察

采用經典和改良的考馬斯亮藍兩種試劑分別測定不同蛋白質含量與最大吸光值（OD值）的線性關系，以評價改良考馬斯亮藍試劑測定蛋白質含量的可行性。

1.7 改良考馬斯亮藍試劑測定蛋白質含量回收率實驗

取20支試管，編號0～20，其中0～5號分別加入不同量的蛋白質標準溶液，用水補足至1 mL，6～14號管分別加入不同量的已知蛋白含量的HP-CTS溶液，用蛋白質標準溶液補足至1 mL，15～20號管分別加入不同量的已知濃度的蛋白質溶液，用水補足至1 mL，按照改良考馬斯亮藍試劑蛋白質含量測定方法測定6～20管中的蛋白質濃度，測得蛋白質含量與理論上已知的蛋白質含量相比較，計算改良考馬斯亮藍試劑法測定蛋白質含量的回收率。

1.8 改良考馬斯亮藍試劑測定蛋白含量的最低檢測限實驗

將25.8 μg·mL-1標準蛋白質溶液稀釋10倍，在紫外分光光度計上測定，以評價改良法測定蛋白質的最低檢出限。

2 結果與分析

2.1 不同酸對考馬斯亮藍試劑pH值、顏色和最大光吸收值的影響

經典的考馬斯亮藍試劑的配制含有85%磷酸，該溶液的顏色為棕黑色，pH為0.58，最大光吸收峰在465 nm，與蛋白質反應后溶液的顏色變?yōu)樗{色，最大吸收峰移至595 nm。在考馬斯亮藍G250試劑用于測定殼聚糖及其衍生物中的蛋白質含量時，考慮到實際中的磷酸為三價強酸，可與具有-NH2/-NH3+的殼聚糖及殼聚糖衍生物產生正負電荷的結合，從而導致殼聚糖及殼聚糖衍生物大分子內或大分子間的絮凝，干擾了溶液的透明度，干擾了測定結果。

本實驗選用了3種酸按比例配制考馬斯亮藍試劑，測定殼聚糖及其衍生物中的蛋白質含量。由表1可知，加入30～50 mL的鹽酸后，試劑最大光吸收峰在465 nm附近，與蛋白質結合反應后其最大光吸收值為（597±1）nm，符合考馬斯亮藍試劑測定蛋白質含量的基本要求。

表1 不同酸的考馬斯亮藍試劑的性質表

2.2 穩(wěn)定性實驗結果

由表2、表3可知，經典法和改良法兩種試劑與蛋白質反應后，溶液隨時間延長其吸收值均相應下降，但20 min內均有很好的穩(wěn)定性。對比40 mL、50 mL兩種濃鹽酸的加入量，加入50 mL濃鹽酸的改良考馬斯亮藍試劑測定殼聚糖及其衍生物蛋白質含量時，溶液在20 min內穩(wěn)定性更好。因此，選擇加入50 mL的濃鹽酸作為改良考馬斯亮藍試劑的配制方法，用于測定殼聚糖及其衍生物的蛋白質含量。

表2 經典考馬斯亮藍試劑與蛋白質形成溶液的穩(wěn)定性實驗結果表

表3 加入不同鹽酸量的考馬斯亮藍試劑與蛋白質形成溶液的穩(wěn)定性實驗結果表

2.3 線性范圍實驗結果

經典和改良考馬斯亮藍試劑測定標準蛋白質溶液的結果見表4，兩種試劑測定標準蛋白質溶液曲線見圖1、圖2。由實驗結果可看出，改良的考馬斯亮藍試劑與經典的考馬斯亮藍試劑測定蛋白質含量的線性數據基本一致，在0～104.0 μg·mL-1蛋白質濃度范圍內，蛋白質濃度與光吸收均呈線性關系，R2分別可達到 0.994 4和 0.994 1。

表4 經典和改良考馬斯亮藍試劑測定標準蛋白質溶液的結果比較表

2.4 回收率實驗結果

用傳統(tǒng)考馬斯亮藍試劑測定蛋白質含量時，羥丙基殼聚糖（HP-CTS）受干擾最大，因此本實驗以蛋白質殘留為陰性的HP-CTS為實驗樣本進行回收率實驗。由表5可知，回收率結果平均值為118.74%，表明用改良的考馬斯亮藍試劑測定殼聚糖及殼聚糖衍生物中微量蛋白質含量，回收率比較好。

圖1 經典考馬斯亮藍試劑的標準曲線圖

圖2 改良考馬斯亮藍試劑的標準曲線圖

表5 改良法測定蛋白含量回收率實驗結果表

2.5 最低檢測限實驗結果

實驗結果表明在蛋白質濃度為1.032 μg·mL-1時，改良試劑與蛋白質溶液反應后在（597±1）nm處仍有吸收，最低檢測限約為 1 μg·mL-1。

2.6 經典和改良的考馬斯亮藍試劑測定CTS、CMCTS、HP-CTS中的蛋白質含量的比較

采用兩種測定試劑分別對CTS溶液、CM-CTS溶液、HP-CTS溶液中的蛋白質含量進行測定，結果見表6。

表6 經典和改良考馬斯亮藍試劑測定CTS、CM-CTS、HP-CTS中蛋白質含量的結果表

由表6可知，經典的考馬斯亮藍試劑測定殼聚糖及其衍生物樣品，殼聚糖及羥丙基殼聚糖溶液中呈現藍色的細小懸浮顆粒，在沉淀不能去除的情況下測定OD值偏高；羧甲基殼聚糖溶液中多為藍色絮狀顆粒，顆粒沉降后的上清液測定OD值反而偏低。而改良的考馬斯亮藍試劑測定上述樣品，檢測液為澄清溶液。經典試劑中的多價磷酸可與殼聚糖及其衍生物的-NH2/-NH3+結合，產生不溶性的絮凝，溶液中形成大量藍色的顆粒狀或絮狀沉淀，若沉淀懸浮在溶液中，測定的結果偏高，若沉淀沉降后，測定的結果又偏低，而采用改良后的考馬斯亮藍試劑測定同一份溶液的蛋白質含量時，溶液澄清透明，原因是消除了沉淀的干擾，測定結果可信。

3 結論

在測定殼聚糖及其衍生物中蛋白質含量時，由于殼聚糖及殼聚糖衍生物本身含有-NH2/-NH3+，能與加入磷酸的經典考馬斯亮藍試劑發(fā)生反應產生絮狀沉淀，干擾了測定結果的準確度。經實驗證明，在配制考馬斯亮藍試劑時用50 mL的濃鹽酸代替磷酸，配制的考馬斯亮藍試劑與蛋白質形成的復合物在20 min內穩(wěn)定，線性R2可達到0.994 1，回收率為118.74%，最低檢測限可達到1 μg·mL-1。在測定殼聚糖及殼聚糖衍生物中蛋白質含量的實驗中，溶液澄清透明，測定的結果可信。