汪菊，付大友，徐晨曦（四川理工學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，四川自貢643000）

奶粉中蛋白質(zhì)含量的快速測(cè)定

汪菊，付大友，徐晨曦
（四川理工學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，四川自貢643000）

摘要：從奶粉中蛋白質(zhì)的快速檢測(cè)方法入手，選取了分光光度法中的考馬斯亮藍(lán)G-250來進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在酸性介質(zhì)中，蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250溶液反應(yīng)生成藍(lán)色絡(luò)合物。該絡(luò)合物最大吸收波長(zhǎng)為594 nm，摩爾吸光系數(shù)為3.75×10-5L/（mol·cm），精密度（RSD）為0.55%，相關(guān)系數(shù)為0.999 3，加標(biāo)回收率為97.8%。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)；考馬斯亮藍(lán)G-250；分光光度法

奶粉中含有豐富的蛋白質(zhì)，是人們?nèi)粘Ｉ钪醒a(bǔ)充蛋白含量不可缺少的來源，并且它的水分含量低，使得比其他奶制品具有更好地運(yùn)輸和儲(chǔ)存能力[1]。但近幾年奶粉安全事件時(shí)有發(fā)生，一些不法商販為了謀利，常向奶粉中添加一些含氮量高的非蛋白質(zhì)物質(zhì)來提高蛋白質(zhì)含量，這些物質(zhì)極有可能會(huì)對(duì)人體造成傷害，如三聚氰胺等。因此，快速、準(zhǔn)確地測(cè)定奶粉中蛋白質(zhì)的含量至關(guān)重要[2]。目前，對(duì)奶粉中蛋白質(zhì)含量測(cè)定的方法已有很多種方法。凱氏定氮法是測(cè)量蛋白質(zhì)含量的經(jīng)典方法，但此方法步驟繁瑣，耗時(shí)耗力。本試驗(yàn)是采用紫外分光光度法測(cè)定奶粉中蛋白質(zhì)含量，采用考馬斯亮藍(lán)G-250作為顯色劑，考馬斯亮藍(lán)法是利用蛋白質(zhì)-染料結(jié)合的原理進(jìn)行染色，定量的測(cè)定蛋白質(zhì)濃度[3]。此法操作簡(jiǎn)單，快速，靈敏度較高，可以得到滿意的結(jié)果。

1　試驗(yàn)原理

1976年，Bradfo rd等建立一種測(cè)定蛋白質(zhì)的考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法），它是根據(jù)考馬斯亮藍(lán)G-250染料所含的疏水基團(tuán)在酸性條件下與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸特別是精氨酸及芳香族氨基酸殘基通過疏水作用結(jié)合形成藍(lán)色蛋白質(zhì)染料復(fù)合物[4]，使染料最大吸收峰的位置（Kmax）由465 nm變?yōu)?95 nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色的原理設(shè)計(jì)的[5]。波長(zhǎng)在595 nm條件下，所測(cè)定吸光度與蛋白質(zhì)濃度成正比。

2　材料與方法

2.1材料與儀器

2.1.1儀器

UV-2000紫外可見分光光度計(jì)：龍尼柯（上海）儀器有限公司；AR1140分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；石英比色皿、比色管及容量瓶等玻璃儀器。

2.1.2材料

2.1.2.190%乙醇溶液

移取90 mL無水乙醇于100 mL容量瓶中，定容至刻度。

2.1.2.2考馬斯亮藍(lán)G-250溶液（0.1 mg/mL）

稱取0.100 0 g考馬斯亮藍(lán)G-250于100 mL燒杯中，用50 mL 90%乙醇溶解，轉(zhuǎn)入至1 000 mL容量瓶中，在此容量瓶中加入100 mL 85%磷酸，用水定容至刻度，該溶液在常溫下可放置1個(gè)月。

2.1.2.3牛血清蛋白溶液（100 μg/mL）

稱取0.010 0 g牛血清蛋白于100 mL燒杯中，溶解，轉(zhuǎn)入至100 mL容量瓶中，定容至刻度。

2.2方法

2.2.1牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別移取 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 100 μg/mL牛血清蛋白溶液于6支比色管中，補(bǔ)水至1.00 mL，5.00 mL 0.1 mg/mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，加入1.50 mL 85%磷酸溶液，搖勻，然后在波長(zhǎng)為594 nm下進(jìn)行測(cè)定。此時(shí)注意溶液必須在6 min內(nèi)測(cè)定完。

2.2.2樣品測(cè)定

稱取0.010 0 g奶粉于100 mL燒杯中，溶解，轉(zhuǎn)入至100 mL容量瓶中，定容至刻度，作為待測(cè)液。然后移取1.00 mL待測(cè)液于25 mL比色管中，然后按2.2.1步驟進(jìn)行。

3　結(jié)果與分析

3.1磷酸最佳量

移取0.40 mL牛血清蛋白溶液于6支比色管中，補(bǔ)水0.60 mL，5.00 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，再分別加入0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL 85%磷酸溶液，然后按2.2.1步驟進(jìn)行，結(jié)果見圖1。

圖1　磷酸最佳量Fig.1　The optimal amount of phosphate

由圖1可知，加入1.5 mL 85%磷酸，吸光度達(dá)到最大，此時(shí)磷酸用量最佳。這是由于磷酸用量太少，溶液顯色效果不明顯，但是磷酸加入量過多，使得溶液顏色過深而影響測(cè)量，導(dǎo)致吸光度偏小。

3.2考馬斯亮藍(lán)G-250最佳量

移取0.40 mL牛血清蛋白溶液于6支比色管中，補(bǔ)水0.60 mL，分別加入2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、8.00 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，然后按2.2.1步驟進(jìn)行，結(jié)果見圖2。

圖2　考馬斯亮藍(lán)G-250最佳量Fig.2　The optimal amount of Bradford G-250

圖2表明，當(dāng)加入4.00 mL～6.00 mL顯色劑考馬斯亮藍(lán)G-250時(shí)，吸光度達(dá)到穩(wěn)定。說明此時(shí)考馬斯亮藍(lán)G-250與牛血清蛋白所形成的復(fù)合物達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，因此考馬斯亮藍(lán)G-250的最佳用量為5.00 mL。

3.3最佳顯色時(shí)間

移取0.40 mL牛血清蛋白溶液于比色管中，然后按2.2.1步驟進(jìn)行，分別反應(yīng)2、4、6、10、15、20 min后，測(cè)定，結(jié)果見圖3。

圖3　最佳顯色時(shí)間Fig.3　The optimal amount of chromogenic time

根據(jù)圖3顯示，顯色時(shí)間在2 min～6 min時(shí)，吸光度達(dá)到最穩(wěn)定。說明時(shí)間對(duì)其所形成的復(fù)合物有一定性的影響，因此溶液必需在6 min中內(nèi)測(cè)定。

3.4牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4是以牛血清蛋白含量為橫坐標(biāo)，所測(cè)吸光度為縱坐標(biāo)，在波長(zhǎng)λ=594 nm下所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其方程為：y=0.004 5x+0.006 1，R2=0.999 3。

3.5精密度及回收率

精密度及回收率見表1。

圖4　牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　Standard curve of bovine serum albumin

表1　精密度及回收率Table 1　The precision and recovery

由表1可以看出，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為RSD=0.55%。從此方法測(cè)定結(jié)果的均值和RSD值來看，該法的重現(xiàn)性好，精密度理想。并且此方法平均回收率達(dá)標(biāo)，表明此法可行。

3.6樣品測(cè)定

樣品測(cè)定結(jié)果見表2。

表2　奶粉測(cè)定結(jié)果Table 2　The results determined by formula

由表2可知，B奶粉中的蛋白質(zhì)含量比A奶粉高7.08%，兩種奶粉中蛋白質(zhì)含量相差不大。并且兩種奶粉的測(cè)定結(jié)果與實(shí)際所買奶粉蛋白質(zhì)含量最大相差0.14%，在誤差允許范圍內(nèi)，因此測(cè)定結(jié)果基本符合要求。

4　結(jié)論

考馬斯亮藍(lán)法由于靈敏度高、測(cè)定快速簡(jiǎn)便、干擾物質(zhì)少等優(yōu)點(diǎn)，得到廣泛應(yīng)用。此方法除測(cè)定奶粉等牛乳中蛋白質(zhì)含量外，還可以推廣到其他乳制品及食品等中蛋白質(zhì)含量測(cè)定，但此法中蛋白質(zhì)與顯色劑所形成的絡(luò)合物穩(wěn)定時(shí)間太短，需要進(jìn)一步研究解決。

參考文獻(xiàn)：

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.036

收稿日期：2014-01-14

基金項(xiàng)目：四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（13ZA0123）

作者簡(jiǎn)介：汪菊（1989—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：工業(yè)分析。

Study on the Fast Determination Method of Protein Content in Milk Power

WANG Ju，F(xiàn)U Da-you，XU Chen-xi
（College of Materials Chemical Engineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

Abstract：The rapid determination method of protein was studied.A Bradford G-250 method among spectrophotometric colorimetry was chosen to determine protein content in milk powder.The results showed that the maximum absorption wavelength of protein and Bradford G-250 red-brown generating blue complex was 594 nm in the acidic medium and the apparent molar absorptive was 3.75×10-5L/（mol·cm），the precision （RSD）was 0.55%，the relevant coefficient was 0.999 3，the recovery of standard addition was 97.8%.

Key words：protein；Bradford G-250；spectrophotometry