陳偉珠，晉文慧，張怡評(píng)，洪專，*（.國(guó)家海洋局第三海洋研究所，福建廈門36005；2.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系，化學(xué)生物學(xué)福建省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門36005）

角鯊烯的高效液相色譜檢測(cè)法

陳偉珠1，2，晉文慧1，張怡評(píng)1，洪專1，*
（1.國(guó)家海洋局第三海洋研究所，福建廈門361005；2.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系，化學(xué)生物學(xué)福建省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361005）

摘要：建立了一種高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定角鯊烯含量的檢測(cè)方法。采用XBridge RP C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，3.5 μm），流動(dòng)相為甲醇，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)器為光電二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，角鯊烯濃度在2.6 μg/mL～260 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r為0.999 9。檢出限（S/N=3）為0.33 μg/mL，定量限（S/N=10）為0.99 μg/mL，精密度RSD（n=6）為0.40%；平均加標(biāo)回收率為100.78%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.75%。方法準(zhǔn)確、靈敏、可靠，可用于角鯊烯的定量和定性分析。

關(guān)鍵詞：角鯊烯；高效液相色譜；光電二極管陣列法；測(cè)定

角鯊烯常溫下為無(wú)色油狀液體，是一種高度不飽和脂肪族烴類化合物。其最初是從鯊魚(yú)的肝油中發(fā)現(xiàn)的，1914年被命名為 Squalene，其化學(xué)名稱為2，6，10，15，19，23—六甲基—2，6，10，14，18，22—二十四碳六烯，屬開(kāi)鏈三萜，又稱魚(yú)肝油萜，也稱鯊烯。目前，角鯊烯主要來(lái)自于深海鯊魚(yú)肝油，同時(shí)也少量存在于油脂不皂化物中，尤其在橄欖油、棕櫚油及其脫臭餾出物中含量較多，菜籽油、大豆油、米糠油、棉籽油等植物油也含有一定量角鯊烯。角鯊烯具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗腫瘤等多種生理功能，可廣泛地應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥、食品等多個(gè)行業(yè)[1]。近些年來(lái)，很多國(guó)家已將其列入藥物行列，如我國(guó)藥典中就將角鯊烯作為口服營(yíng)養(yǎng)藥，劑量為每天1 g。

雖然角鯊烯對(duì)人體健康有諸多益處，但也有證據(jù)表明過(guò)量的角鯊烯會(huì)產(chǎn)生一定副作用。科學(xué)家給老鼠注射角鯊烯后，發(fā)現(xiàn)老鼠患上了免疫系統(tǒng)疾病。目前，人們更多地關(guān)注角鯊烯對(duì)人體健康帶來(lái)的益處，功能性食品市場(chǎng)上此類產(chǎn)品眾多，但是至今為止，我國(guó)尚未出臺(tái)關(guān)于角鯊烯測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或者規(guī)范性文件。本課題旨在研究角鯊烯含量測(cè)定的快速簡(jiǎn)便靈敏方法，以對(duì)市場(chǎng)日益增多的此類產(chǎn)品提供質(zhì)量監(jiān)控手段。目前，關(guān)于角鯊烯檢測(cè)方法有氣相色譜法[2-8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9-10]、高效液相色譜法[4，11-14]以及超高效液相色譜法[15]，但分析時(shí)間都比較長(zhǎng)，一個(gè)樣品至少要10 min以上，即使榮維廣[15]建立的超高效液相色譜法，樣品的出峰時(shí)間也要9.9 min。本文采用高效液相色譜法對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，樣品的分析時(shí)間比文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC法時(shí)間短，也比超高效液相色譜法短，且靈敏度高，準(zhǔn)確性好，是一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、環(huán)保的檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1主要儀器和試劑

1.1.1儀器

Waters 2695高效液相色譜儀配光電二極管陣列檢測(cè)器：美國(guó)Waters公司；Milli-Q純水機(jī)：德國(guó)Millipole公司。

1.1.2試驗(yàn)試劑

甲醇、乙腈（色譜純）；角鯊烯（純度≥99%）：美國(guó)sigma公司。

1.2色譜條件

液相色譜柱：XBridge RP C18（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：甲醇；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

角鯊烯儲(chǔ)備液的制備：精密稱取角鯊烯16.3 mg，用乙腈溶解，置于10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻配成角鯊烯儲(chǔ)備液1630 μg/mL。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的選擇

2.1.1色譜柱的選擇

角鯊烯，極性很弱，適合用反相色譜柱。所以本試驗(yàn)選用C18的反相柱。Agilent SB-C18（5 μm，250 mm× 4.6 mm），但是即使流速為2 mL/min，樣品出峰時(shí)間約13 min，出峰時(shí)間太長(zhǎng)。改用XBridge RP C18（250 mm× 4.6mm，3.5μm），流速為1mL/min，出峰時(shí)間為7.044min（圖1），比Agilent SB-C18出峰時(shí)間短，所以本試驗(yàn)決定采用XBridge RP C18（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）作為角鯊烯的分析色譜柱。

圖1　100℃高溫破壞的角鯊烯的色譜圖Fig.1　The chromatography of squalene destroyed by hightemperature

2.1.2流動(dòng)相的選擇

采用乙腈和甲醇作為流動(dòng)相體系，試驗(yàn)結(jié)果表明甲醇和乙腈作為流動(dòng)相，100℃高溫破壞的角鯊烯樣品主峰均能與其它雜質(zhì)峰分開(kāi)。但是以乙腈作為流動(dòng)相，樣品的保留時(shí)間較甲醇長(zhǎng)，所以本試驗(yàn)選擇甲醇作為流動(dòng)相體系。為了考察甲醇/水的不同比例對(duì)角鯊烯樣品的分離效果的影響，本試驗(yàn)在柱溫為35℃和流動(dòng)相流速為1 mL/min的相同條件下，改變甲醇/水的比例。試驗(yàn)結(jié)果表明（如圖2所示），樣品在甲醇和水不同比例的流動(dòng)相條件下都能與雜質(zhì)峰分開(kāi)，但是隨著水比例從0%增加到5%，樣品的保留時(shí)間增加，當(dāng)水增加到5%時(shí)，樣品主峰的保留時(shí)間為13.6 min。綜合考慮樣品的保留時(shí)間和分離效果，選擇純甲醇作為流動(dòng)相。

圖2　在不同流動(dòng)相條件下，100℃高溫破壞的角鯊烯的色譜圖Fig.2　The chromatography of squalene destroyed by hightemperature under the different mobile phase

2.1.3柱溫的選擇

在甲醇作為流動(dòng)相和流速為1 mL/min的相同條件下，改變柱溫，考察柱溫對(duì)分離效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明（如圖3所示），柱溫為30、35、40℃，樣品保留時(shí)間分為為6.7、7.0、7.3 min，且樣品主峰跟其它雜質(zhì)峰分離良好。綜合考慮樣品的保留時(shí)間和柱子的使用壽命，柱溫選擇35℃。

圖3　在不同柱溫條件下，100℃高溫破壞的角鯊烯的色譜圖Fig.3　The chromatography of squalene destroyed by hightemperature under the different column temperature

2.2檢出限與定量下限

將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋后，以信噪比S/N=3時(shí)的質(zhì)量濃度為檢出限，S/N=10時(shí)的質(zhì)量濃度為定量下限。計(jì)算得出檢出限為0.33 μg/mL，定量限為0.99 μg/mL。

2.3線性關(guān)系

取角鯊烯對(duì)照品適量，精密稱定13.0 mg，用乙腈溶解，置于10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻配成角鯊烯儲(chǔ)備液1 300 μg/mL。精密量取不同體積的儲(chǔ)備液，配制濃度為2.6、6.5、13.0、32.5、130、260 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，精密量取10 μL注入液相色譜儀，以峰面積（Y）對(duì)溶液的質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸（如表1所示）。

表1　角鯊烯線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果Table 1　The result of linear relation between concentrationof squalene and peak area

結(jié)果表明，角鯊烯濃度在2.6 μg/mL～260 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=3500 2X+1962 3 （r=0.999 9）。

2.4精密度與重現(xiàn)性

取2.3項(xiàng)配置的濃度為130 μg/mL的溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果如表2所示，峰面積的RSD（n=6）為0.40%，表明儀器精密度良好。

2.5溶液穩(wěn)定性

按“標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備”方法配制角鯊烯溶液濃度為144 μg/mL，于室溫（25℃左右）中放置0、2、4、8、12、24 h后分別按優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得到RSD（n=6）為0.63%（見(jiàn)表3），表明樣品溶液在室溫條件下能穩(wěn)定保存。

表2　精密度結(jié)果Table 2　The result of precision

表3　穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Table 3　The result of precision

2.6加標(biāo)回收率

精密稱取不同量的角鯊烯，按照“供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，在相當(dāng)于供試品溶液80%、100%、120%的濃度下，分別考察加標(biāo)回收率。每個(gè)濃度制備3份，以供試品溶液峰面積平均值和對(duì)照品溶液峰面積平均值的比值作為回收率。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　加標(biāo)回收試驗(yàn)Table 4　Result of recovery test

該方法的平均回收率為100.78%，RSD為0.75%，表明方法的回收率良好。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)建立了角鯊烯的檢測(cè)方法，使用反相柱對(duì)角鯊烯含量進(jìn)行直接檢測(cè)，角鯊烯峰與其他雜質(zhì)峰得到很好分離，且經(jīng)方法學(xué)考察表明，線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率等均符合分析要求，方法準(zhǔn)確。

而且該方法的流速不僅比文獻(xiàn)[14]報(bào)道的方法低，且樣品的保留時(shí)間縮短，節(jié)約溶劑和時(shí)間，尤其適合高通量樣品的檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1]官波,鄭文誠(chéng).角鯊烯提取、純化及其應(yīng)用[J].糧食與油脂,2010 (2):44-46

[2]鄒海民,曹鑄,曾紅燕.功能食品中角鯊烯的氣相和液相色譜方法比較[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2014,41(2):293-299

[3]周茂君,向仕學(xué),殷德桂,等.保健食品中角鯊烯的氣相色譜分析[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志,2003,19(2):186-187

[4]王啟輝,劉洋,張經(jīng)華,等.氣相色譜法同時(shí)測(cè)定人血清中角鯊烯和5種非膽固醇類固醇的報(bào)告[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,9 (4):721-725

[5]鐘冬蓮,湯富彬,沈丹玉,等.油茶籽油中角鯊烯含量的氣相色譜法測(cè)定[J].分析試驗(yàn)室,2011,11(30):104-106

[6]謝勇,蘇素嬌,梁一池.氣相色譜法測(cè)定茶籽油中角鯊烯含量的研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,33(1):42-44

[7]宗萬(wàn)里,曲淑霞,魯剛.毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定角鯊烯軟膠囊中角鯊烯含量[J].生命科學(xué)儀器,2012,10(6):7-9

[8]王軍,翁幼竹,蘇永全,等.福建近海姥鯊肝油中角鯊烯的分離測(cè)定[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2002,41(4):506-508

[9]趙明橋,李攻科,欒天罡,等.固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定海水中角鯊烯及其與赤潮的關(guān)系[J].分析化學(xué),2000,28(11): 1326-1330

[10]耿樹(shù)香,寧德魯,張艷麗,等.不同品種及成熟度橄欖油中角鯊烯的檢測(cè)分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2013(3):79-81

[11]龔麗,常偉,黃湛,等.橄欖油中角鯊烯的提取與檢測(cè)[J].食品與發(fā)酵科技,2013,49(5):72-74

[12]梁新華,鄭彩霞,張風(fēng)俠,等.甘草角鯊烯的提取及高效液相色譜分析[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,32(3):123-126

[13]張欣,于瑞祥,楊瑞鈺,等.植物油中角鯊烯的提取與高效液相色譜法分析[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2013,28(5):96-99

[14]Hai-Tao Lu,Yue Jiang,Feng Chen.Preparative separation and purification of squalene from the microalga Thraustochytrium ATCC 26185 by high-speed counter-current chromatography[J].Journal of Chromatography A,2003,994(1/2):37-43

[15]榮維廣,劉華良,李莉,等.超高效液相色譜法測(cè)定保健食品中角鯊烯[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志,2013,29(8):734-736

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.034

收稿日期：2014-07-02

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015N0009）；廈門海洋研究開(kāi)發(fā)院共建項(xiàng)目（2014）；海洋生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化中試技術(shù)研發(fā)公共服務(wù)平臺(tái)（12PZP001SF10）；廣東海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目（GD2012-D01-001）

作者簡(jiǎn)介：陳偉珠（1981—），女（漢），助理研究員，碩士，研究方向：海洋天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品研制與分析。

*通信作者

Determination of Squalene by High Performance Liquid Chromatography with Photodiode Array Detector

CHEN Wei-zhu1，2，JIN Wen-hui1，ZHANG Yi-ping1，HONG Zhuan1，*
（1.The Third Instiute of Oceanography，State Oceanic Administration，Xiamen 361005，F(xiàn)ujian，China；2.Department of Chemistry，College of Chemistry and Chemical Engineering，The Key Laboratory for Chemical Biology of Fujian Province，Xiamen University，Xiamen 361005，F(xiàn)ujian，China）

Abstract：A high-performance liquid chromatography method for the determination of squalene was developed.The determination of squalene was performed on a XBridge RP C18column（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）.The mobile phase was methanol，and the flow rate was 1.0 mL/min.The detector was photodiode array detector and the variable wavelength detector（VWD）was set at 210 nm.In the above chromatographic conditions，good linear was observed in the linear range of 2.6 μg/mL-260 μg/mL，and the correlation coefficient r was 0.999 9. The limit of detection（LOD）of squalene was 0.33 μg/mL（S/N=3）.The quantitation of detection（QOD）of squalene was 0.99 μg/mL（S/N=10）.The relative standard deviation（RSD）for the accuracy was 0.40%（n=6） and the average recovery was 100.78%with RSD of 0.75%.The method is sensitive，reliable，accurate and could be used for the determination of squalene.

Key words：squalene；high-performance liquid chromatography（HPLC）；photodiode array detector（PAD）；determination