石 超，陳怡飛，賈振宇，孫 怡，郭 都，楊保偉，楊 華，夏效東,

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021）

克羅諾腸桿菌（Cronobacter spp.），原名為Enterobacter sakazakii，是周生鞭毛、能運動、兼性厭氧的無芽孢革蘭氏陰性菌[1-2]?？肆_諾腸桿菌包含7 個種，分別為阪崎克羅諾腸桿菌（C. sakazakii）、丙二酸鹽克羅諾腸桿菌（C. malonaticus）、都柏林克羅諾腸桿菌（C. dublinensis）、莫金斯克羅諾腸桿菌（C. muytjensi）、尤尼沃斯克羅諾腸桿菌（C. universaIis）、康帝蒙提克克羅諾腸桿菌（C. condimenti）和蘇黎世克羅諾腸桿菌（C. turicensis），其中阪崎克羅諾桿菌是引起新生兒感染的主要病原菌，它能夠引起菌血癥、敗血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎和腦膜炎等多種疾病，致死率高達50%～80%[3-4]。阪崎克羅諾腸桿菌在自然界中廣泛存在，如土壤、螫蠅、水稻、小麥、草藥和香料、肉類及一些家庭常見食物中[5]。它能在低水分活度的環(huán)境中存活，這種特性使其能在嬰幼兒乳粉中存活兩年及以上[6]。Fei Peng等[7]對2009—2012年中國嬰幼兒乳粉及嬰幼兒乳粉工廠的70 份樣品進行了分離鑒定，發(fā)現(xiàn)阪崎克羅諾腸桿菌是最主要的分離菌。

起初有研究報道阪崎克羅諾腸桿菌對包括β-內(nèi)酰胺類的多種抗生素敏感，但是，近期研究報道，一些菌株對四環(huán)素、新霉素和甲氧芐啶等抗生素具有抗性[8]。耐藥菌株的出現(xiàn)，尤其是一些多重耐藥菌株在全球的流行，給預(yù)防和控制細菌感染帶來諸多困難[9]。合成的食品防腐劑往往具有潛在的毒性，并且隨著社會的發(fā)展進步和人民生活水平的提高，消費者對天然和有機食品的市場需求日益增長，這一現(xiàn)狀使得尋求天然、安全、高效且又不易導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生的天然防腐抑菌和抗感染物質(zhì)成為了近年的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，可食用并且具有多種生理功能的草本植物和它們的精油提取物由于含有大量的次級代謝產(chǎn)物從而可以抑制或殺滅細菌、酵母和霉菌[10]。

近幾年，一些研究報道了部分植物源提取物對阪崎克羅諾腸桿菌具有抑制作用，包括藍莓花青素和市售的藍莓果汁[11]、反式肉桂醛[12]、葡萄籽水溶性提取物和紅葡萄汁[13]。然而，由于阪崎克羅諾腸桿菌研究歷史較短，大量的天然植物源抑菌劑對阪崎克羅諾腸桿菌的抑制作用未進行探究，并且，目前國內(nèi)外研究通常是探究不同的實驗室條件或不同食品模型中天然植物源抑菌物質(zhì)對阪崎克羅諾腸桿菌的抑制作用，而未對多種物質(zhì)進行統(tǒng)一條件和標(biāo)準(zhǔn)的評價與篩選，且對部分天然植物源化合物出現(xiàn)重復(fù)性研究。

因此，本研究通過前期查閱文獻選取了50 種包括多酚類、黃酮類、醌類、萜類和皂苷類等天然植物源化合物，通過牛津杯法測定植物源化合物對阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌圈大小，利用瓊脂稀釋法測定其對阪崎克羅諾腸桿菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），評價篩選對阪崎克羅諾腸桿菌有高效抑菌活性的植物源物質(zhì)，旨在為阪崎克羅諾腸桿菌的控制提供新的思路，也為植物源抑菌劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

阪崎克羅諾腸桿菌（C. sakazakii）ATCC 29544、ATCC 29004、ATCC 12868和ATCC BAA-894購于美國模式菌株收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）。阪崎克羅諾腸桿菌分離菌株12-2、14-15、18-7、18-8和18-13由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品微生物研究團隊分離自市售嬰幼兒奶粉及米粉，采用臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（2011）標(biāo)準(zhǔn)測定并判讀菌株藥敏結(jié)果，確定耐藥表型（表1）。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soya broth，TSB） 北京陸橋技術(shù)有限公司；氨芐西林、肉桂醛、百里醌 美國Sigma公司；其他有機試劑均為國產(chǎn)分析純；其余天然植物源化合物均購于成都曼思特生物科技有限公司；植物源活性物質(zhì)的提取來源見表2。實驗時使用TSB溶液（含體積分數(shù)0.5%的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液）配制10 mg/mL植物活性物質(zhì)的母液，并使用0.22 μm的硝化纖維濾膜過濾除菌備用。

表1 實驗所用5 株嬰幼兒食品分離菌的來源及藥敏結(jié)果Table1 Sources and antibiotic resistance of five isolates from foods for infants and young children

1.2 儀器與設(shè)備

YT-CJ-LND超凈工作臺 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；TH2-312恒溫搖床 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；LMQ.CE高壓蒸汽滅菌鍋 山東新華醫(yī)療器械有限公司；Smart SpecTMplus分光光度計 美國Bio-Rad公司；5804R低溫冷凍離心機 德國Eppendorf公司；YC-260C 4 ℃冰箱 合肥美菱股份有限公司；JA2003電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；Vortex 6漩渦儀海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將凍存于－80 ℃的阪崎克羅諾腸桿菌采用劃線法在TSA平板上活化，挑取單菌落接種于30 mL的TSB中，將其置于37 ℃培養(yǎng)18 h，使細菌處于對數(shù)生長后期，培養(yǎng)后的菌懸液經(jīng)5 000×g離心15 min，去除上清液，使用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌菌體沉淀，反復(fù)3 次洗滌后，使用一定量的PBS懸浮菌體沉淀，測定并調(diào)整菌懸液OD600nm至0.5，使菌懸液濃度約為108CFU/mL。

1.3.2 抑菌圈的測定

參考王娣等[14]的方法利用牛津杯法測定抑菌圈，并作略微修改。將TSA培養(yǎng)基溶解均勻后高壓滅菌，待冷卻至50 ℃左右，使用無菌移液器準(zhǔn)確量取20 mL轉(zhuǎn)移至水平放置的無菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基冷卻凝固后備用。按照1.3.1節(jié)的方法制備菌懸液，測定并調(diào)整ATCC 29544菌懸液OD600nm至0.5（約108CFU/mL），使用PBS稀釋菌懸液，使菌懸液濃度約為107CFU/mL，并取100 μL菌懸液均勻涂布至TSA平板上。隨后夾取滅菌且烘干的牛津杯（外徑8 mm、內(nèi)徑6 mm、高10 mm）置于TSA平板上，使用鑷子調(diào)整使牛津杯放置水平并輕輕按壓，每個培養(yǎng)皿中均勻放置3 只牛津杯。隨后向牛津杯中添加200 μL植物源化合物溶液（質(zhì)量濃度為10 mg/mL）。將培養(yǎng)皿正置放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，使用游標(biāo)卡尺測量透明抑菌圈的直徑。以不含有植物源化合物的TSB培養(yǎng)液（含體積分數(shù)0.5% DMSO溶液）作為陰性對照，以含有1 mg/mL氨芐西林的TSB培養(yǎng)液（含體積分數(shù)0.5% DMSO溶液）為陽性對照。每個植物源化合物設(shè)置3 個重復(fù)，計算平均值。

1.3.3 MIC的測定

MIC的測定參考歐洲藥敏試驗委員會（European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）的方法[15]，將TSA培養(yǎng)基溶解均勻后高壓滅菌，待冷卻至50 ℃左右，加入24 孔細胞培養(yǎng)板中，向其中加入植物源化合物溶液，使植物源化合物的質(zhì)量濃度分別為5.00、2.50、1.25、1.00、0.80、0.60、0.50、0.40、0.30、0.20、0.15 mg/mL和0.10 mg/mL，吹打使植物源化合物與培養(yǎng)基充分混勻，每孔中培養(yǎng)基最終體積為500 μL，等待培養(yǎng)基冷卻凝固。按照1.3.1節(jié)中的方法制備菌懸液，調(diào)整菌懸液濃度至OD600nm為0.5（約108CFU/mL），吸取2 μL菌懸液接種至24 孔板各孔中央。實驗以不含有植物源化合物的TSA培養(yǎng)基作為陰性對照，以含有1 mg/mL氨芐西林的TSA培養(yǎng)基作為陽性對照。將樣品置于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀測結(jié)果，MIC為肉眼觀測下，植物源化合物使阪崎克羅諾腸桿菌不生長的最小質(zhì)量濃度。每個質(zhì)量濃度設(shè)置3 個重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示（n＝3），使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對阪崎克羅諾腸桿菌有抑菌活性的植物源化合物的初步篩查

實驗對含所選取的50 種植物源化合物的阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544培養(yǎng)基中抑菌圈直徑進行了測定（表2），其中具有肉眼可見抑菌圈的植物源化合物共有40 種。其中，抑菌圈平均直徑不小于13 mm的植物源化合物有：香芹酚、百里醌、百里酚、肉桂醛、檸檬醛、原兒茶醛和原兒茶酸；抑菌圈平均直徑為12～13 mm的植物源化合物有：丹皮酚、阿魏酸、丁香酸和硫辛酸。抑菌圈平均直徑為11～12 mm的植物源化合物有：大蒜素、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、菊苣酸、苦參堿和沒食子酸。含其他植物源化合物培養(yǎng)基的抑菌圈的平均直徑都小于10 mm。

在所檢測的40 種植物源化合物中，香芹酚和百里酚對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544有著最強的抑制效果，二者的MIC均為0.1 mg/mL。對比天然植物源化合物對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544的抑菌圈及MIC結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對阪崎克羅諾腸桿菌生成抑菌圈較大的植物源化合物，其MIC較小，兩組結(jié)果較為吻合。

表2 實驗中所用植物源化合物對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544的抑菌圈直徑及MICTable2 Growth inhibition zone diameter and MIC against C. sakazakii strain ATCC 29544 of plants-derived compounds used in this work

2.2 植物源化合物對阪崎克羅諾腸桿菌抑菌活性的評價

對于阪崎克羅諾腸桿菌引起的腸道炎癥和系統(tǒng)性的感染，抗生素（如頭孢噻肟和慶大霉素類）是目前主要的控制手段[16]。然而抗生素治療不僅會引起耐藥菌株的出現(xiàn)，還會影響早產(chǎn)兒的腸道免疫和營養(yǎng)功能，并使腸道原始菌相造成破壞，導(dǎo)致新生兒念珠菌病的風(fēng)險增大[17-18]。為增強實驗結(jié)果的廣泛性，在本研究中，選取了具有不同藥物敏感性的4 株ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株及5 株食品來源分離菌株（表1），測定植物源化合物對這9 株阪崎克羅諾腸桿菌的MIC（表3）。

表3 植物源化合物對阪崎克羅諾腸桿菌的MICTable3 MIC of plant-derived compounds against C. sakazakii mg/mL

根據(jù)表2可知，對ATCC 29544的MIC不小于5 mg/mL的植物源化合物共18 種，選擇除苦參堿（對人畜具有低毒性）以外的17 種植物源化合物繼續(xù)進行研究。在所檢測的17 種植物源化合物中，百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌有著最強的抑菌效果，兩者對9 株阪崎克羅諾腸桿菌的MIC均為0.1～0.2 mg/mL；百里醌、肉桂醛、檸檬醛和原兒茶醛也有良好的抑菌效果，四者的MIC為0.30～1.25 mg/mL；MIC為2.5～5.0 mg/mL的植物源化合物有：阿魏酸、綠原酸、丁香酸、硫辛酸、原兒茶酸、表兒茶素、咖啡酸、丹皮酚和菊苣酸（表3）。

本研究選取的50 種天然植物源化合物中，15 種植物源化合物是酚類化合物（丹酚酸B、松蘿酸、阿魏酸、綠原酸、丁香酸、原兒茶酸、咖啡酸、沒食子酸、菊苣酸、山柰酚、丹皮酚、百里酚、香芹酚、表兒茶素和厚樸酚）。由表2抑菌圈結(jié)果可知，除山柰酚以外，含其他14 種酚類植物源化合物的阪崎克羅諾腸桿菌培養(yǎng)基中均有較為明顯的抑菌圈。除丹酚酸B、松蘿酸、山柰酚和厚樸酚以外，其他11 種植物源化合物對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544的MIC均小于等于5 mg/mL。這說明酚類物質(zhì)對阪崎克羅諾腸桿菌有著較好的抑菌作用。酚類物質(zhì)具有多種化學(xué)結(jié)構(gòu)，是次級代謝產(chǎn)物中最多樣的一類物質(zhì)，其羥基基團（—OH）被認為是發(fā)揮抑菌作用的主要原因[19]。并且，酚酸類物質(zhì)被證明能夠作用于細菌的細胞膜，并破壞細菌的細胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物流出[20-21]。

百里酚（圖1A）和香芹酚（圖1B）是一對同分異構(gòu)的酚類單萜物質(zhì)，在本研究中對阪崎克羅諾腸桿菌有著最強的抑菌效果。兩者在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別僅為酚羥基在苯環(huán)上的位置不同，物理性質(zhì)主要為熔點不同，香芹酚常溫下為液體，而百里酚常溫下為固體粉末。香芹酚和百里酚已經(jīng)被歐盟委員會（European Commission，EU）認定可作為食品中的調(diào)味劑（Regulation EU 872/2012），并已被證明對蠟狀芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌作用[22]，Xu等[23]研究表明，百里酚和香芹酚對大腸桿菌有相似的抑菌效果，MIC均為0.2 mg/mL，但是其對阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌活性尚無報道。

百里醌（圖1C）對阪崎克羅諾腸桿菌有著良好的抑菌作用，其MIC為0.3～0.6 mg/mL。百里醌是天然調(diào)味品黑種草的主要生物活性成分[24]，其半數(shù)致死量（lethal dose 50%，LD50）是2 400 mg/kg[25]，并已被證明具有抗氧化、抗高血壓、抗炎、抗腫瘤、抗誘變劑、抗組胺和止痛等多種藥理學(xué)功能[26]。Forouzanfar等[27]研究表明，百里醌對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌及銅綠假單胞菌具有抑菌作用。

肉桂醛（圖1D）對阪崎克羅諾腸桿菌的MIC為0.4～1.0 mg/mL。肉桂醛是肉桂樹皮提取物的主要成分，自然界中天然存在的肉桂醛均為反式結(jié)構(gòu)。由于其具有肉桂香氣，目前被應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥制品和香水中。肉桂醛具有抗癌、抗炎、治療糖尿病、降低細菌耐藥性等多種生物活性[28]。Ooi等[29]通過瓊脂稀釋法檢測肉桂醛對多種細菌的MIC，結(jié)果表明肉桂醛對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、霍亂弧菌、副溶血型弧菌和鼠傷寒沙門氏菌的MIC為75～600 μg/mL。

在本研究中，檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌也有著良好的抑菌作用，其對阪崎克羅諾腸桿菌的MIC為0.30～0.60 mg/mL。檸檬醛是一類單萜化合物，是檸檬草油的主要成分，常以幾何異構(gòu)體橙花醛（圖1G）和香葉醛（圖1H）的形式存在。目前，檸檬醛作為香辛料已廣泛應(yīng)用于加工食品和飲料中（如軟飲料和甜點）[30]。一些實驗及臨床研究表明，檸檬醛具有良好的抗炎、防腐和抑菌作用[31-33]，本研究首次評價了其對阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌活性。

原兒茶酸（圖1F）和原兒茶醛（圖1E）有著相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但兩者對阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌效果卻差異明顯（原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌的MIC為0.60～1.25 mg/mL，但原兒茶酸的MIC為2.50～5.00 mg/mL）；這可能歸因于它們的結(jié)構(gòu)及疏水性的不同[34]。使用ACD/ChemSketch 2012軟件分析了兩種化合物的疏水性，計算了原兒茶酸和原兒茶醛的油水分配系數(shù)（lg（Po/w））（lg（Po/w）值指某物質(zhì)在正辛烷（油）和水中的分配系數(shù)的對數(shù)值，反映了物質(zhì)在油-水兩相中的分配情況，lg（Po/w）值越大說明該物質(zhì)越親油，反之則越親水）。兩者的lg（Po/w）分別為1.16±0.24和1.14±0.27，并無顯著差異。因此推測：兩者抑菌作用的不同可能是由原兒茶醛的官能基團醛基（—CHO）與原兒茶酸的官能基團羧基（—COOH）所導(dǎo)致。

阿魏酸（圖1L）與咖啡酸（圖1K）都為酚酸類物質(zhì)，且有較為相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其二者對阪崎克羅諾腸桿菌的MIC分別為2.50～5.00 mg/mL和5.00 mg/mL。阿魏酸存在于多種食物中，如米糠、綠茶和咖啡豆中[34-35]，并常常存在于植物細胞壁的半纖維素中[36]；其已被證實具有抗氧化、預(yù)防動脈粥樣硬化和抗炎等多種生理功能活性[37]。阿魏酸對食源性致病菌的抑制作用也多有報道，Campos等[38]發(fā)現(xiàn)它能夠破壞乳酸菌的細胞壁，影響細胞膜正常的通透性；Ga?an等[39]證明100 mg/L的阿魏酸能夠降低空腸彎曲桿菌的存活能力。

丁香酸（圖1I）存在于多種食物及中草藥中，如香菇、谷物、石斛、板藍根[40]和距花山姜的葉子[41]。前期研究表明，丁香酸能夠防治慢性肝損傷的肝纖維化[42]，并能在糖尿病小鼠模型中治療糖尿病[41]。丁香酸對多種微生物的抑制作用也有大量研究，Zaldivar等[43]發(fā)現(xiàn)丁香酸能夠通過改變胞內(nèi)離子濃度從而抑制大腸桿菌LY01的生長并能降低乙醇的產(chǎn)量。并且，500 mg/L丁香酸能夠在90 min內(nèi)使PBS中酒類酒球菌的數(shù)量下降4.5（lg（CFU/mL））（起始菌量為7.0（lg（CFU/mL）））[44]。

硫辛酸含有兩個巰基基團，通常以氧化態(tài)（圖1M）和還原態(tài)（圖1N）形式存在[45]，它存在于菠菜、花椰菜、西紅柿、豌豆、豆芽、米糠和動物內(nèi)臟等多種食品中[46]，其在人體血清內(nèi)的質(zhì)量濃度為16 mg/L[47]。前期研究表明，硫辛酸因能螯合金屬離子從而具有較強的抗氧化能力，能夠消除加速老化與致病的自由基，修復(fù)細胞氧化損傷[48]。越來越多的研究表明，硫辛酸是能夠調(diào)控免疫功能和炎癥反應(yīng)基因的核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear transcription factor，NF）-κB的重要抑制劑[49]。除此之外，大量實驗及臨床研究證明硫辛酸有潛力被用作治療糖尿病、肝功能損傷、動脈粥樣硬化和HIV感染[50-51]。由于上述特性，硫辛酸已在多個國家被用作膳食補充劑[52-53]。

實驗所檢測的50 種植物源化合物中，多種物質(zhì)作為抑菌劑抑制細菌或作為民間醫(yī)藥治療食源性致病菌所導(dǎo)致的疾病已有悠久的歷史。并且，一些物質(zhì)（百里酚、香芹酚、檸檬醛和肉桂醛）已被美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）評價為公認安全的食品成分；因此，這些植物源化合物有潛力作為植物源抑菌劑添加入食品中，或用于食品包裝和食品加工、流通和運輸過程的抑菌處理。本實驗的開展為天然植物源化合物在抑制阪崎克羅諾腸桿菌的研究方面提供了參考。

圖1 部分植物源化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of plant-derived compounds

3 結(jié) 論

本研究評價了50 種植物源化合物對阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌活性。結(jié)果表明：百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌有著最強的抑制作用，對9 株阪崎克羅諾腸桿菌的MIC為0.10～0.20 mg/mL；百里醌、肉桂醛、檸檬醛和原兒茶醛有良好的抑菌效果，四者的MIC為0.30～1.25 mg/mL；阿魏酸、綠原酸、丁香酸、硫辛酸、原兒茶酸、表兒茶素、咖啡酸、丹皮酚和菊苣酸的MIC為2.50～5.00 mg/mL。以上結(jié)果表明，多種植物源抑菌劑對阪崎克羅諾腸桿菌有著良好的抑菌活性，有潛力作為抑菌劑在食品加工、流通、貯藏過程中應(yīng)用，從而發(fā)揮其控制阪崎克羅諾腸桿菌的作用。本研究為阪崎克羅諾腸桿菌的控制提供了新的思路，也為植物源抑菌劑的開發(fā)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，但植物源抑菌劑的抑菌機制及在食品中的應(yīng)用方式需要進一步探究。