姚行行，郭 妍，莊永亮

（昆明理工大學(xué) 云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500）

膠原蛋白是動物體內(nèi)含量豐富的蛋白質(zhì)，所有多細胞動物都含有膠原蛋白[1]。膠原蛋白具有良好的生物相容性、生物降解性以及弱抗原性[2]，被廣泛應(yīng)用于皮革工業(yè)、制藥業(yè)、生物醫(yī)學(xué)以及食品工業(yè)等行業(yè)，如制備生物材料和人造皮膚[3-4]、可食性或可生物降解的膠原膜[5]，促進肌肉組織愈合的傷口敷料[6]以及降解制備生物活性因子和保健食品等。近年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖和加工產(chǎn)業(yè)得到迅猛發(fā)展，魚類加工下腳料等為主要組成的產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)品產(chǎn)量越來越大[1]。研究表明，魚加工下腳料，特別是魚皮、魚骨，富含膠原蛋白，是非常豐富的膠原蛋白潛在資源。

膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白，呈纖維狀，在水溶液中的溶解性較差，但易溶于酸性介質(zhì)，因此在制備過程中經(jīng)常使用低溫酸溶液提取法。Chuaychan[7]和Hu Jinhua[8]等以有機酸為溶劑分別制備了魚源酸溶性膠原蛋白。此外，研究表明，有機酸低溫提取能夠最大程度上保留膠原三螺旋結(jié)構(gòu)及其生物活性[1]。

云南深水鯛魚養(yǎng)殖是云南高原特色水產(chǎn)養(yǎng)殖的龍頭產(chǎn)業(yè)。云南鯛魚是海水紅鯛與淡水尼羅非魚的雜交品種，一般生活在深淡水中，據(jù)統(tǒng)計，云南省2016年云南鯛魚總產(chǎn)量為24.5萬 t，其中加工處理6.3萬 t。目前，云南鯛魚的加工主要以制作生魚片為主，從而產(chǎn)生了大量的下腳料，主要包括魚頭、尾、骨、皮、鱗、內(nèi)臟及其殘留魚肉[9]。本實驗主要從云南鯛魚加工下腳料魚骨中低溫提取制備酸溶性膠原蛋白（acid-soluble collagen，ASC），并研究分析其理化性質(zhì)，以期為云南鯛魚骨的綜合利用和精深加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云南鯛魚骨由云南海王水產(chǎn)有限公司提供，用刀剔除殘留魚肉，自來水清洗干凈后切成小塊，－25 ℃存儲備用。

蛋白Marker 大連寶生物工程有限公司；胰蛋白酶上海源葉生物科技有限公司；乙腈（色譜級） 德國默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901紫外-可見光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Q Exactive Focus高分辨質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher公司；L-8900氨基酸分析儀、S-4800型電子顯微鏡 日本日立公司；DYCZ-25E型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；DSC 214 Polyma型差示掃描量熱儀 德國耐馳公司；傅里葉變換紅外光譜儀 美國布魯克光學(xué)公司。

1.3 方法

1.3.1 ASC的制備

魚骨ASC的提取參考文獻[10]并稍作修改。按1∶20（m/V，下同）將鯛魚骨置于0.1 mol/L NaOH溶液中攪拌除去非膠原物質(zhì)（2 d，每隔12 h換液），清洗至中性，按1∶20加入0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二鈉鹽（pH 7.5）攪拌進行脫鈣處理（5 d，每隔24 h換液），然后按料液比1∶20加入體積分數(shù)10%正丁醇溶液攪拌除去魚骨中的脂肪（2 d，每隔24 h換液），最后按1∶40加入0.5 mol/L pH 2.6乙酸溶液攪拌3 d，提取魚骨膠原蛋白，提取結(jié)束后，過濾，按料液比1∶40向殘渣中加入0.5 mol/L乙酸溶液，攪拌1 d進行二次提取，兩次濾液合并，4 ℃、13 000×g離心1 h，上清液用0.9 mol/L NaCl鹽析，攪拌過夜，4 ℃、13 000×g離心15 min，沉淀溶于0.5 mol/L乙酸，轉(zhuǎn)入透析袋用去離子水透析2 d，冷凍干燥，制備鯛魚ASC，稱質(zhì)量，計算ASC的得率，結(jié)果表示為g/100 g魚骨。

1.3.2 氨基酸組成測定

稱取0.1 g ASC于玻璃水解管中，加入6 mL 6 mol/L鹽酸溶液，110 ℃水解22 h。采用L-8900氨基酸分析儀測定水解氨基酸組成。

1.3.3 SDS-PAGE分析

參照Laemmli[11]的方法對ASC進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。將ASC置于含有1% SDS和3.5 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）中，100 ℃加熱5 min使其溶解，離心，取上清液以4∶1（V/V）的比例與緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl、4% SDS、20%甘油、含或不含10% β-巰基乙醇，pH 6.8）混合，沸水浴5 min后上樣。采用7.5%的分離膠和5.0%的濃縮膠。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜測定

參考Tamilmozhi等[12]的方法對ASC進行傅里葉變換紅外光譜分析。準確稱取1 mg樣品與100 mg KBr混合碾磨，壓片后置于樣品架上進行光譜掃描，掃描范圍400～4 000 cm－1。

1.3.5 紫外光譜吸收測定

取150 mg ASC溶于50 mL 0.5 mol/L乙酸中，用0.5 mol/L的乙酸為對照進行紫外光譜掃描，掃描范圍190～400 nm。

1.3.6 熱特性測定

稱取一定量ASC于坩堝中，密封，在0～250 ℃范圍內(nèi)測定其差示掃描量熱圖譜，升溫速率為10 ℃/min，以空坩堝作為參照。

1.3.7 X射線衍射

使用Empyrean型X射線衍射儀對ASC進行X射線衍射圖譜分析。采用Cu靶Kα射線，λ＝0.154 nm。掃描2θ為5°～40°。

1.3.8 微觀結(jié)構(gòu)測定

S-4800型掃描電子顯微鏡觀察ASC的顯微結(jié)構(gòu)，倍數(shù)分別采用200×、500×和2 000×。

1.3.9 膠原的肽段組成測定

稱取2 g ASC溶于150 mL磷酸鹽緩沖液中（0.05 mol/L，pH 7.5），按酶與底物質(zhì)量比為1∶25加入胰蛋白酶，37 ℃水解30 min，沸水浴15 min終止反應(yīng)，6 000×g離心20 min，透析脫鹽，冷凍干燥。水解液的肽片段利用Q Exactive Focus質(zhì)譜儀進行高分辨質(zhì)譜分析，分析方法同先前研究[13]，從http://www.uniprot.org/網(wǎng)站下載“fish collagen”數(shù)據(jù)庫，利用MaxQuant Server（Version 1.5.3.28）軟件對ASC水解肽的質(zhì)譜信息與“fish collagen”數(shù)據(jù)庫進行比對分析。

1.3.10 pH值對相對溶解度影響的測定

將ASC溶解于0.5 mol/L乙酸中，制備3 mg/mL ASC溶液，6 mol/L HCl溶液或6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 1～10，4 ℃振蕩30 min，4 ℃、13 000×g離心20 min。用雙縮脲法測定上清液中蛋白質(zhì)的含量，計算ASC的相對溶解度，以pH值為橫坐標作溶解性曲線。

1.3.11 NaCl質(zhì)量分數(shù)對溶解度影響的測定

將ASC溶解于0.5 mol/L乙酸中，制備6 mg/mL ASC溶液，加入NaCl溶液，最終ASC溶液中NaCl質(zhì)量分數(shù)分別為0、1%、2%、3%、4%、5%、6%，4 ℃振蕩30 min，4 ℃、13 000×g離心20 min，測定上清液蛋白含量，計算ASC的相對溶解度，以NaCl質(zhì)量分數(shù)為橫坐標作溶解性曲線。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用Origin 8.5軟件進行數(shù)據(jù)處理以及作圖，數(shù)據(jù)為3 次實驗的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯛魚ASC制備及氨基酸組成

表1 鯛魚ASC的氨基酸組成Table1 Amino acid composition of ASC

采用低溫乙酸提取鯛魚ASC，鯛魚骨中ASC的得率為3.15 g/100 g魚骨。由表1可知，鯛魚骨ASC具有天然膠原蛋白氨基酸組成的基本特征，即以甘氨酸為主要組成氨基酸，占總數(shù)的35.04%；其次是丙氨酸和脯氨酸含量較高，分別占12.26%和11.66%。羥脯氨酸是膠原蛋白中的特征氨基酸，它由脯氨酸經(jīng)脯氨酸羥化酶催化氧化而成，具有穩(wěn)定膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的作用[14]，結(jié)果表明ASC中的羥脯氨酸含量為6.90%，羥化率為37.18%。這一結(jié)果與深海紅魚骨膠原蛋白的結(jié)果相似[15]。此外，ASC中蛋氨酸，異亮氨酸，酪氨酸和組氨酸含量較低，而半胱氨酸未檢測到。

2.2 鯛魚ASC的SDS-PAGE分析

膠原蛋白分子呈三螺旋結(jié)構(gòu)，由3條α多肽鏈相互纏繞而成。由圖1的電泳結(jié)果顯示，ASC中含有1條β鏈和至少2條α鏈，即α1和α2鏈。α1鏈含量較高，分子質(zhì)量約為130 kDa，由于α1和α3在單相垂直電泳中無法分離，因此，α1鏈中可能含有；α2鏈含量較少，分子質(zhì)量約為110 kDa。魚骨ASC中還含有大量β鏈，分子質(zhì)量約為200 kDa。在β鏈的上方還檢測到一些相對分子質(zhì)量較高的電泳帶，可能是ASC的γ成分，γ鏈應(yīng)是α鏈通過架橋結(jié)合而形成的高分子質(zhì)量成分。此外，是否添加β-巰基乙醇，ASC電泳圖譜未見差異，表明ASC分子中不含二硫鍵，這與氨基酸組成中不含半胱氨酸結(jié)果相吻合。云南鯛魚骨ASC的電泳圖譜與鯉魚[17]、鮰魚[18]以及虹鱒魚皮[19]等多種水產(chǎn)動物膠原蛋白的電泳圖譜相似。綜上結(jié)果可推斷ASC為Ⅰ型膠原蛋白。

2.3 鯛魚ASC的傅里葉變換紅外光譜特征

圖1 鯛魚ASC的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE patterns of ASC

圖2 鯛魚ASC的傅里葉變換紅外光譜Fig. 2 Fourier transform infrared spectrum of ASC

傅里葉變換紅外光譜是研究膠原蛋白結(jié)構(gòu)的重要方法之一。如圖2所示，ASC具有典型的膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜特征吸收峰，即含有酰胺A、B及Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ帶。酰胺A帶與N—H基團的伸縮振動有關(guān)，游離酰胺A帶的吸收峰出現(xiàn)在3 400～3 440 cm－1，當含有N—H基團的分子肽段參與氫鍵鍵合時，其吸收峰將發(fā)生藍移。鯛魚ASC的吸收峰為3 442 cm－1，這一結(jié)果表明ASC中沒有或僅有很少的N—H基團參與了氫鍵的鍵合。酰胺B帶是由于—CH2不對稱的伸縮振動引起的，由圖2可知，鯛魚骨ASC的酰胺B帶的吸收峰為2 915 cm－1。

酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ帶與膠原蛋白分子的結(jié)構(gòu)相關(guān)，是反映蛋白質(zhì)肽鏈骨架結(jié)構(gòu)的最重要吸收峰。其中，酰胺Ⅰ帶歸屬于多肽鏈上—C＝O鍵的伸縮振動吸收峰，為蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的敏感區(qū)，常被用來分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；酰胺Ⅱ帶歸屬于α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的扭轉(zhuǎn)振動峰；酰胺Ⅲ帶歸屬于甘氨酸和脯氨酸殘基的—CH2特征振動峰，它的存在可以說明ASC三維螺旋結(jié)構(gòu)的完整性。由圖2中可知，ASC含有酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ帶的特征吸收峰，分別在1 631、1 540、1 240 cm－1處。以上結(jié)果表明，低溫酸法提取云南鯛魚骨ASC較好的保持了其三維結(jié)構(gòu)的完整性。

2.4 鯛魚ASC紫外吸收特征

圖3 鯛魚ASC紫外掃描圖譜Fig. 3 UV spectrum of ASC

由于羰基、羧基和酰胺基等發(fā)色基團的存在，膠原蛋白分子能夠吸收一定波長的紫外光線。如圖3所示，ASC的最大吸收峰出現(xiàn)在230 nm，而在260～280 nm范圍內(nèi)沒有明顯的光吸收，這是因為ASC中芳香族氨基酸，如酪氨酸和苯丙氨酸等含量較低產(chǎn)生的[18]。鯛魚骨ASC的紫外吸收圖譜與文獻[20-21]報道的水產(chǎn)動物膠原蛋白結(jié)果一致，符合Ⅰ型膠原蛋白紫外吸收特征。

2.5 鯛魚ASC熱穩(wěn)定性分析

差示掃描量熱法是一種熱分析技術(shù)，通過測定樣品熱焓的變化來研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，被大量應(yīng)用于蛋白質(zhì)熱變性研究領(lǐng)域[22]。鯛魚骨ASC的差示掃描量熱圖譜如圖4所示，在0～250 ℃范圍內(nèi)，ASC有2 個熱吸收峰（T1和T2）。T1與釋放束縛在膠原分子的水以及膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的降解有關(guān)；T2指的是膠原蛋白交聯(lián)部分的熔融溫度[23]。鯛魚骨ASC的熱變性溫度T1和T2分別為86.5 ℃和226.2 ℃，略高于北梭魚膠原的熱變性溫度（T1＝80.1 ℃、T2＝203.1 ℃）[24]，表明ASC有較好的熱穩(wěn)定性。膠原蛋白的熱轉(zhuǎn)變或變性溫度不同主要是由于膠原間蛋白水分含量、氨基酸組成、膠原蛋白提取方法以及棲息地的溫度差異引起的[24]。

圖4 鯛魚ASC的差示掃描量熱圖譜Fig. 4 Differential scanning calorimetry thermogram of ASC

2.6 鯛魚ASC的X射線衍射特征

圖5 鯛魚ASC的X射線衍射圖譜Fig. 5 X-ray diffraction diagram of ASC

如圖5所示，ASC有3 個衍射峰。峰1出現(xiàn)在5°～10°之間，該峰峰型尖銳，反映了膠原纖維分子鏈之間的距離；峰2出現(xiàn)在20°附近，為一個寬且大的衍射峰，是由ASC分子內(nèi)部復(fù)雜的結(jié)構(gòu)層次引起的漫散射產(chǎn)生的；峰3出現(xiàn)在30°～35°之間，峰型小而尖銳，該峰反映了膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)上相鄰氨基酸殘基之間的距離[25]。

根據(jù)布拉格方程2dsin θ＝λ，計算ASC中各個衍射峰的d值（X射線的波長為0.154 nm）。計算結(jié)果如表2。

表2 鯛魚ASC X射線衍射峰對應(yīng)d值Table2 d values for X-ray diffraction peaks of ASC

由表2可知，鯛魚骨膠原纖維分子鏈之間的距離為1.15 nm，略小于比目魚皮膠原纖維分子鏈之間的距離[26]，說明鯛魚骨膠原分子排列較為整齊緊湊，分子鏈間的距離較小。峰2衍射峰對應(yīng)的d值比羅非魚鱗膠原的略大[25]。在膠原蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)中，每圈螺旋含有3.3 個氨基酸殘基，螺距為0.96 nm，沿著螺旋中心軸，相鄰氨基酸殘基間的距離為0.29 nm，這與研究結(jié)果峰3的d值一致。以上結(jié)果表明，低溫酸法提取后鯛魚骨ASC很好地保持了其原有的結(jié)構(gòu)。

2.7 鯛魚ASC的顯微結(jié)構(gòu)

膠原蛋白的顯微結(jié)構(gòu)是膠原實際應(yīng)用的重要參數(shù)之一[27]。由圖6a、b可知，ASC經(jīng)放大后呈三維立體的空間結(jié)構(gòu)，由絲狀和薄片狀的纖維相互交聯(lián)而成，分布規(guī)則且均勻；由圖6c可知，ASC表面細膩光滑，無折疊褶皺現(xiàn)象，這與Li Zhongrui等[10]研究的馬鮫魚骨膠原顯微結(jié)構(gòu)類似，說明ASC在提取過程中基本保持了其原有的纖維結(jié)構(gòu)，比較適合作為食品、藥品、化妝品、保健品以及生物醫(yī)學(xué)材料的基料。

圖6 鯛魚ASC的掃描電子顯微鏡圖像Fig. 6 Scanning electron microscopic images of ASC

2.8 鯛魚ASC多肽片段分析

表3 鯛魚ASC胰蛋白酶水解肽段及氨基酸組成Table3 Amino acid composition of peptide fragments from ASC digested by trypsin

鯛魚骨ASC的胰蛋白酶水解產(chǎn)物用高分辨質(zhì)譜進行分析，結(jié)合MaxQuant軟件對比蛋白肽氨基酸序列組成。對照UNIPROT中“fish collagen”數(shù)據(jù)庫檢測到ASC肽段可信度高于80%的有92 條，高于90%的有29 條多肽鏈（表3）。由表3可知，ASC肽段中C端主要的氨基酸為賴氨酸和精氨酸，這符合胰蛋白酶的水解特征。多肽片段的氨基酸構(gòu)成主要為Gly-X-Y，符合膠原蛋白的一級結(jié)構(gòu)的特點[28]。該結(jié)果為進一步研究鯛魚骨ASC的一級結(jié)構(gòu)和生理活性提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2.9 鯛魚ASC的溶解性質(zhì)

2.9.1 pH值對ASC相對溶解度的影響

圖7 pH值對云南鯛魚ASC相對溶解度的影響Fig. 7 Effect of pH on the relative solubility of ASC

如圖7所示，隨著pH值的升高，ASC的相對溶解度呈先升高后下降再略有回升的趨勢。在酸性條件下，膠原溶解度較大，在pH 4時達到最大值。ASC為典型的兩性聚電解質(zhì)溶解性，它的溶解性與等電點密切相關(guān)。在等電點附近，膠原蛋白靜電荷較小，因而溶解度較小；偏離等電點，膠原蛋白靜電荷較大，分子分散性較好，溶解度較大[29]。由圖7可知，鯛魚ASC等電點在pH 7附近，這與Li Zhongrui等[10]報道的膠原蛋白的等電點為pH 6～9的結(jié)果一致。上述膠原蛋白溶解性特點在許多水產(chǎn)動物的膠原中都有報道[14,30]。

2.9.2 NaCl質(zhì)量分數(shù)對ASC相對溶解度的影響

圖8 NaCl質(zhì)量分數(shù)對鯛魚ASC相對溶解度的影響Fig. 8 Effect of NaCl concentration on the relative solubility of ASC

如圖8所示，ASC的相對溶解度在NaCl質(zhì)量分數(shù)在0%～4%之間相對穩(wěn)定，僅有微小的波動，當NaCl質(zhì)量分數(shù)大于4%以后，相對溶解度隨NaCl質(zhì)量分數(shù)的增大而劇烈下降。鹽離子通常以兩種方式影響蛋白質(zhì)的溶解性。在低質(zhì)量分數(shù)時，鹽離子能和膠原蛋白結(jié)合，使膠原蛋白所帶正電荷增加，分子間相互排斥，因而分散性好，相對溶解度也越大；在鹽離子質(zhì)量分數(shù)較高時，鹽離子可與周圍水分子結(jié)合形成水化膜，使蛋白質(zhì)脫水而鹽析，導(dǎo)致溶解度的降低[31]。

3 結(jié) 論

本實驗對云南鯛魚ASC進行提取并分析了其理化性質(zhì)。測定了ASC的得率及氨基酸組成，SDS-PAGE測定了其分子質(zhì)量的大小及膠原蛋白類型，傅里葉變換紅外光譜、紫外光譜和X射線衍射分析其膠原分子的結(jié)構(gòu)特征，差示熱量掃描法分析其熱變性溫度，肽段序列分析其酶解特性和一級結(jié)構(gòu)，掃描電子顯微鏡顯示ASC分子分布及立體結(jié)構(gòu)。ASC溶解性研究顯示其在pH 4以及NaCl質(zhì)量分數(shù)為4%時達到最大溶解度。綜上結(jié)果表明，ASC適合于食品、藥品和保健品等行業(yè)的需求，本實驗為云南鯛魚骨綜合利用提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。