楊　嵐，尹火青，唐　娟，袁　濤，楊煥治，陳三春，張　城，彭國平1，，3

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙　410128；2 湖南省博世康中醫(yī)藥有限公司，湖南懷化　418000；3 道地藥用植物規(guī)范化栽培與綜合利用湖南省工程實驗室，長沙　410128)

茯苓是多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，載于《中國藥典》中，作為我國傳統(tǒng)的藥食兩用的中藥已有2 000多年的悠久歷史，茯苓的主要研究集中在其次生代謝產(chǎn)物上，研究最多的是茯苓多糖，茯苓多糖及其衍生物羧甲基茯苓多糖具有調(diào)節(jié)免疫力[1]、抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、調(diào)節(jié)血糖[4]、降血脂[5]和保肝[6]等藥理作用。對茯苓中含量少的蛋白質(zhì)和氨基酸的研究較少，僅有許輔等[7]對茯苓的一種新型免疫調(diào)節(jié)蛋白的純化與生理活性在巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子有關(guān)的基因表達(dá)的初步研究。因此，本實驗分析了3個茯苓品種蛋白質(zhì)與氨基酸的含量，為茯苓蛋白質(zhì)類的藥效研究以及茯苓蛋白類保健品產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料、儀器與試劑

茯苓材料為“野生型”“湘靖28”“輻射一號”新鮮茯苓菌核，“湘靖28”是在“野生型”中選育出來的，“輻射一號”是輻射育種得到的材料，均同時采自湖南省靖州縣茯苓基地同一塊地。

R-1001N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；722N可見分光光度計，上海精科；KQ-3200E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；全自動凱氏定氮儀，Unit，F(xiàn)OSS TecatorTMDigestor Auto；5417R冷凍高速離心機，德國Eppendorf公司；L-8900日立全自動氨基酸分析儀，KjeltecTM8400 Analyzer；牛血清蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250，其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)AR級。

1.2　試驗材料處理

將3個品種的新鮮茯苓菌核分別切薄片，45℃恒溫干燥至恒重并粉碎，100目篩子過篩備用。

1.3　蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密配置0.5mg/mL的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照稀釋倍數(shù)原則分別將其稀釋，取14支10mL具塞刻度試管編號，分別加入牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，配置標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL，每個試管標(biāo)號做3個平行組。在每個試管中加入5.0mL現(xiàn)配的考馬斯亮藍(lán)G-250，混勻靜置 3min，用722N可見分光光度計在595 nm處比色，記錄溶液吸光度繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

1.4　茯苓蛋白質(zhì)的提取與測定

1.4.1醇溶性蛋白的提取精密稱取茯苓干粉末5g于研缽中，加15mL 50%乙醇，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，4℃、12 000r/min常溫超聲振蕩20min，高速冷凍離心20min。取上清液，即為蛋白質(zhì)粗提液。

1.4.2水溶性蛋白的提取精密稱取茯苓干粉末5g于研缽中，加15mL蒸餾水，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，常溫超聲振蕩20min，4℃、12 000r/min高速冷凍智能離心20min后取上清液，為蛋白質(zhì)粗提液。

1.4.3茯苓總蛋白的測定凱氏定氮法測定：精密稱取1g茯苓干粉末于消化管中，按順序依次加入催化劑CuSO40.5g、K2SO410g和濃H2SO420mL，置于反應(yīng)器上消化，時間180min，消化溫度410℃，打開空氣過濾器，計算3個茯苓樣品蛋白質(zhì)的百分含量。

1.4.4茯苓醇溶性蛋白的測定 考馬斯亮藍(lán)法測定[8]：取蛋白質(zhì)粗提液1mL，對照組用1mL超純水代替蛋白質(zhì)粗提液并編號，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250后混勻靜置3min，用722N可見分光光度計在595 nm處測定吸光度。

1.4.5茯苓水溶性蛋白的測定 考馬斯亮藍(lán)法測定：采用真空低溫蒸餾法[9]將蛋白質(zhì)粗提液濃縮5倍，取1mL蛋白質(zhì)濃縮液于試管中并編號，對照組用1mL超純水代替蛋白質(zhì)濃縮液，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250后混勻靜置3min，用722N可見分光光度計在595 nm處測定吸光度。

1.5　茯苓樣品中氨基酸的檢測

1.5.1氨基酸測定茯苓氨基酸按GB/T 5009.124—2003測定，每個樣品準(zhǔn)備10g。

1.5.2樣品預(yù)處理精密稱取3份等量的茯苓干粉末，置于水解管中冰浴30min，加入2mL預(yù)先冷卻的過甲酸溶液，0℃靜置18 h，加入氫溴酸0.3mL，于0℃搖勻靜置30min，通入氮氣1min，放入110℃的恒溫干燥箱中水解24 h，冷卻至室溫，加超純水定容至100mL容量瓶，混合均勻后加入2mL 0.02mol/L的鹽酸溶液，用0.2μm的濾膜過濾，濾液上機檢測。

1.5.3進(jìn)樣檢測設(shè)置檢測波長為570 nm，其中設(shè)置脯氨酸檢測波長為440 nm。根據(jù)日立公司的使用手冊配制標(biāo)準(zhǔn)，泵1(洗脫溶液)，流速0.40mL/min(壓力2.0～14.7 MPa)；泵2(茚三酮溶液)，流速0.35mL/min(壓力2.0～14.7 MPa)；分析柱溫度57℃；反應(yīng)溫度135℃；進(jìn)樣體積20μL。樣品測定完后系統(tǒng)自行清洗，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并打印報告。

2　結(jié)果與分析

2.1　茯苓氨基酸測定結(jié)果

在本研究中，未檢出的酪氨酸(Tyr)和半胱氨酸(Cys)是由于該儀器原因檢測的此2種氨基酸含量具有不可靠性，并非是指該測試樣品中不含此2種氨基酸，故剔除Tyr和Cys的結(jié)果。經(jīng)氨基酸全自動檢測儀檢測(表1)，3個茯苓樣品中各氨基酸含量除個別氨基酸Ala、Arg、Lys外，含量高低都符合野生型>輻射一號>湘靖28的規(guī)律，3個品種的茯苓所含氨基酸種類齊全，輻射一號的8種必需氨基酸含量較豐富，盡管出現(xiàn)了一定差異，但基本在同一個數(shù)量級。

表1　3個茯苓品種的氨基酸檢測結(jié)果單位：g/100g

表2　3個茯苓品種的蛋白含量單位：mg/g

2.2　蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

(1)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]：牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y=0.076X+0.02，R2=0.997 9，R2>0.99 5，其線性相關(guān)性好。(2)總蛋白含量測定：用凱氏定氮法分別測得3個茯苓品種的總蛋白含量如表2，總蛋白含量高低為野生型>湘靖28>輻射一號，輻射一號與湘靖28在總蛋白含量上差異不明顯。(3)醇溶性蛋白含量測定：用考馬斯亮藍(lán)G-250法測得吸光度值，依據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到醇溶性蛋白含量高低為野生型>輻射一號>湘靖28，輻射一號與湘靖28的醇溶性蛋白含量高低與水溶性蛋白含量高低并不成一致的相關(guān)性。(4)水溶性蛋白含量測定：用考馬斯亮藍(lán)G-250法測得其吸光度，依據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出水蛋白質(zhì)含量如表2，3個茯苓品種水溶性蛋白含量高低為野生型>湘靖28>輻射一號，與總蛋白含量成一致的規(guī)律。(5)在提取茯苓蛋白質(zhì)時，因為茯苓樣品中蛋白質(zhì)含量很低，需要研磨充分，超聲輔助提取，用低濃度乙醇提取所得蛋白質(zhì)的含量相對較高，這與濃縮過程中蛋白質(zhì)降解有關(guān)。

3　討論與結(jié)論

至今被公認(rèn)的茯苓的主要功效成分是茯苓多糖和三萜類化合物，對于茯苓中的蛋白質(zhì)和氨基酸等含量較低的成分研究應(yīng)用較少，對茯苓的研究不是很完善，不利于闡述茯苓的功效并開展實際應(yīng)用。本實驗比較了3個茯苓品種的氨基酸與蛋白質(zhì)的含量，結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)差異不明顯，在氨基酸含量方面，傳統(tǒng)的野生型最具明顯優(yōu)勢，輻射一號優(yōu)于湘靖28，輻射一號總蛋白和游離氨基酸含量高于湘靖28；從新品種選育來看，輻射一號是營養(yǎng)價值相對高、保健作用最好的材料，是相對較優(yōu)的品種，可以作為新品種進(jìn)行推廣。蛋白質(zhì)和游離氨基酸的含量比較可更為全面地評價和控制中藥茯苓的質(zhì)量，而茯苓中蛋白質(zhì)的研究是一個值得關(guān)注的新方向，為茯苓新品種選育和茯苓保健品研究奠定基礎(chǔ)?！?/p>