梁東梅 ，李玉鵬 ，杜艷芬 ，朱 琪 ，安建勇 ，崔茂盛 ，李治欣，喬家運(yùn)，楊卓婧，王文杰，李海花 *

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；3.賽默飛世爾（上海）儀器有限公司，上海 201206；4.河南省洛陽(yáng)市老城區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南洛陽(yáng)471000）

腸道是機(jī)體最大的免疫器官，是防御外來(lái)病原菌感染的第一道防線（Ohland和Macnaughton，2010）。豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的主要危害仔豬腸道健康的一種多發(fā)病。雖然利用抗生素能夠預(yù)防該病的發(fā)生，但是長(zhǎng)期使用也會(huì)產(chǎn)生諸多的負(fù)面效應(yīng)（Cameron等，2016），因此提高仔豬自身抵抗力是有效防控仔豬大腸桿菌病的有效途徑。乳酸桿菌是仔豬腸道中最早定植的菌群之一，其能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，維持腸道菌群平衡（Ren等，2015），改善仔豬腸道屏障 （劉海鴻等，2017），增強(qiáng)仔豬免疫力（周建國(guó)等，2014），減輕致病菌引起的腸道損傷，提高生長(zhǎng)性能 （Qiao等，2015；Yang等，2014），有望替代抗生素在仔豬飼糧中使用。本研究從健康豬糞便中分離鑒定出三株乳酸桿菌，并利用豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）模

型，研究了這三株乳酸菌在IPEC-J2細(xì)胞上黏附的特點(diǎn)、對(duì)致病性大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制作用和黏附抑制作用，并進(jìn)行了比較，為在仔豬飼糧中選擇性添加使用該乳酸菌提供了依據(jù)，為深入研究乳酸桿菌調(diào)節(jié)仔豬腸道屏障功能奠定了基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 細(xì)胞和菌株 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）K88菌株購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心。豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）株購(gòu)買(mǎi)于上海冠導(dǎo)生物工程有限公司。

1.2 主要試劑 RPMI Medium 1640 basic培養(yǎng)液、胰蛋白酶EDTA消化液和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，青鏈霉素、PBS緩沖液、硫酸慶大霉素和TritonX-100均購(gòu)自北京索萊寶生物公司，TRIzol試劑盒、Taq 酶、10×buffer、dNTPs 均購(gòu)買(mǎi)于上海生工生物工程股份有限公司，MRS培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基均為自制。

1.3 乳酸桿菌分離 無(wú)菌條件下取28日齡健康斷奶仔豬新鮮糞便10 g，平均分成兩份，一份放入凍存管中-80℃保存，另一份在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌生理鹽水稀釋至10-4、10-5和10-6梯度，分別取0.2 mL糞便稀釋液接種于選擇性培養(yǎng)基MRS中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。挑取形態(tài)疑似的單克隆菌落在MRS上繼續(xù)培養(yǎng)，然后不斷挑取單克隆菌落進(jìn)行劃線，直至得到純凈單一菌落。

1.4 乳酸桿菌生理生化及PCR鑒定 依照 《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》觀察菌株的形態(tài)并測(cè)定其生化反應(yīng) （布?jí)文虾图舅梗?984）。根據(jù)乳酸桿菌16S rRNA保守序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物 （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’），引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。采用TRIzol試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，并以之為模板，利用乳酸菌鑒定的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為（50 μL）：Taq 酶（5 U/μL）1 μL，DNA模板 2 μL，10×buffer 5 μL，上、下游引物各 1 μL，dNTPs（10mM each）1 μL，PCR 水 39 μL。 PCR 反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min、94 ℃ 25 s、62 ℃ 25 s、72 ℃1 min 30 s、40個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸 3 min、16 ℃2 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。將PCR產(chǎn)物純化后送金唯智生物公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考菌株序列進(jìn)行比對(duì)，確定所分離的三株乳酸桿菌的屬種。

1.5 乳酸桿菌抑菌活性能力的測(cè)定 活菌計(jì)數(shù)法：將三株乳酸桿菌分別接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃靜置過(guò)夜培養(yǎng)，然后5000 r/min 4℃離心10 min，收集培養(yǎng)上清液，置4℃保存?zhèn)溆?。將上述三株乳酸菌培養(yǎng)上清液分別與大腸桿菌溶液（濃度為 1.68×109cfu/mL）混合作用，作用時(shí)間分別為 0、5、15、30 min 和 60 min， 然后將大腸桿菌凃布LB培養(yǎng)板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。每個(gè)菌株的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別做3次重復(fù)。

牛津杯法 （杜金城等，2016)：在直徑10 cm培養(yǎng)皿中加入15 mL含2%瓊脂的無(wú)菌水，靜置。待瓊脂凝固后，用無(wú)菌鑷子把牛津杯等距離放入培養(yǎng)皿中。將大腸桿菌（1×108cfu/mL）及LB固體培養(yǎng)基（10 mL）混勻倒入培養(yǎng)皿中，待其凝固后將牛津杯取出，并分別將三種乳酸桿菌培養(yǎng)上清液（150 μL）加入牛津杯孔中，其中每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)，用MRS培養(yǎng)液做空白對(duì)照。將培養(yǎng)皿置4℃冰箱2 h，待培養(yǎng)上清液擴(kuò)散后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后測(cè)定抑菌圈直徑。

1.6 乳酸桿菌黏附豬小腸上皮細(xì)胞能力測(cè)定用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI Medium-1640 basic培養(yǎng)基培養(yǎng)IPEC-J2細(xì)胞，培養(yǎng)條件是37℃、5%CO2，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，消化細(xì)胞并接種于兩塊24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/孔），待細(xì)胞生長(zhǎng)密度至50%，分別加入植物乳桿菌、唾液乳桿菌和嗜酸乳桿菌（濃度均為5×107cfu/孔），置細(xì)胞培養(yǎng)箱分別孵育3、6 h和24 h，棄去培養(yǎng)液，用不含血清的DMEM清洗3次以去除未黏附的乳酸桿菌，然后向其中一塊培養(yǎng)板每孔加入100 μL 0.5%TritonX-100，37℃孵育8 min以裂解細(xì)胞，再加入900 μL PBS終止裂解，吹打混勻后吸出樣品。將樣品進(jìn)行梯度稀釋后，涂布MRS培養(yǎng)板厭氧培養(yǎng)48 h，進(jìn)行乳酸桿菌計(jì)數(shù)，此時(shí)乳酸桿菌數(shù)（C1）為IPEC-J2細(xì)胞吞噬和黏附的乳酸菌總數(shù)；另一塊培養(yǎng)板每孔加入含100 μg/mL慶大霉素的培養(yǎng)液0.4 mL，孵育2 h。棄去慶大霉素，按照上述方法裂解細(xì)胞并終止反應(yīng)，并對(duì)乳酸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)和計(jì)數(shù)，此時(shí)乳酸桿菌數(shù) （C2）為IPEC-J2細(xì)胞吞噬的乳酸桿菌數(shù)。黏附的乳酸菌活菌數(shù)量=乳酸桿菌數(shù)C1-乳酸桿菌數(shù)C2。

1.7 乳酸桿菌抑制大腸桿菌黏附豬小腸上皮細(xì)胞能力的測(cè)定 將IPEC-J2細(xì)胞分別接種于兩塊 24孔培養(yǎng)板（細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/孔），待細(xì)胞生長(zhǎng)密度至50%，分別加入植物乳桿菌、唾液乳桿菌及嗜酸乳桿菌 （濃度為5×107cfu/孔），孵育細(xì)胞6 h，分別用大腸桿菌K88（濃度為5×106cfu/孔）刺激細(xì)胞 0、3、6 h 和 24 h。 刺激結(jié)束后按照乳酸桿菌黏附豬小腸上皮細(xì)胞能力試驗(yàn)中的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解和大腸桿菌計(jì)數(shù)。黏附的大腸桿菌活菌數(shù)量=大腸桿菌數(shù)C1-大腸桿菌數(shù)C2。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 使用Excel和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，比較不同乳酸桿菌不同時(shí)間點(diǎn)黏附IPEC-J2細(xì)胞的能力以及乳酸桿菌抑制大腸桿菌K88黏附IPEC-J2細(xì)胞能力是否具有顯著性差異。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用單因素ANOVA進(jìn)行方差分析，并采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察 分離純化的乳酸桿菌菌株經(jīng)37℃厭氧培養(yǎng)24 h后，呈圓形凸起、不透明、乳白色或灰白色、邊緣整齊光滑的單菌落，經(jīng)過(guò)革蘭氏染色鏡檢，初步判定分離菌株為桿狀的革蘭氏陽(yáng)性菌。對(duì)單個(gè)菌落進(jìn)行劃線保存，得到三株純凈單一菌落，編號(hào)分別為L(zhǎng)1、L2、L3。

2.2 乳酸桿菌生化及PCR鑒定 三株分離菌株生化鑒定結(jié)果如表1，根據(jù) 《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》確定編號(hào)L1、L2、L3為乳酸桿菌。

表1 三株分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，乳酸桿菌L1、L2和L3的PCR擴(kuò)增條帶大小分別約1500 bp，與預(yù)期產(chǎn)物條帶大小相符。將目的條帶進(jìn)行膠回收純化并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L1菌株與植物乳桿菌同源性達(dá)99.45%，L2菌株與唾液乳桿菌同源性達(dá)99.36%，L3菌株與嗜酸乳桿菌同源性達(dá)98.21%，因此本研究分離的乳酸桿菌L1、L2和L3菌株分別為植物乳桿菌、唾液乳桿菌和嗜酸乳桿菌。

圖1 三株菌16SrRNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 乳酸桿菌抑制大腸桿菌能力的測(cè)定 三株乳酸桿菌培養(yǎng)上清液抑制大腸桿菌能力的結(jié)果見(jiàn)表2和表3。如表2所示，植物乳桿菌抑菌圈直徑為30.8 mm，唾液乳桿菌和嗜酸乳桿菌抑菌圈直徑分別為18.7、16.6 mm，可見(jiàn)三株乳酸桿菌培養(yǎng)上清液對(duì)大腸桿菌均有良好的抑制效果，其中以植物乳桿菌的抑菌效果最好，同時(shí)MRS培養(yǎng)液對(duì)照組的抑菌圈直徑為0 mm，說(shuō)明MRS培養(yǎng)液對(duì)大腸桿菌無(wú)抑制作用?；罹?jì)數(shù)法結(jié)果如表3所示，與植物乳桿菌作用0 min相比，植物乳桿菌作用 5、15、30 min和60 min后抑菌力均是 100%；與唾液乳桿菌作用0 min相比，唾液乳桿菌作用5、15、30 min和 60 min后抑菌力分別提高了20%、21%、24%和52%；與嗜酸乳桿菌作用0 min相比，嗜酸乳桿菌作用5、15、30 min和60 min后抑菌力分別提高了9%、18%、24%和51%，并且隨著乳酸桿菌作用時(shí)間的延長(zhǎng)其抑菌效果也最明顯，牛津杯法和活菌計(jì)數(shù)法檢測(cè)的抑菌效果一致。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，三株乳酸桿菌能夠有效抑制大腸桿菌生長(zhǎng)，其抑菌能力強(qiáng)弱依次是植物乳桿菌、唾液乳桿菌和嗜酸乳桿菌。

表2 牛津杯法測(cè)三株乳酸桿菌抑制大腸桿菌能力的結(jié)果mm

表3 活菌計(jì)數(shù)法測(cè)三株乳酸桿菌抑制大腸桿菌能力的結(jié)果109cfu/mL

2.4 乳酸桿菌黏附IPEC-J2細(xì)胞能力的測(cè)定三株乳酸桿菌黏附IPEC-J2細(xì)胞能力的結(jié)果如表4，與植物乳桿菌作用細(xì)胞3 h相比，植物乳桿菌作用細(xì)胞6 h和24 h時(shí)其黏附數(shù)分別增加了18%和7%；與唾液乳桿菌作用細(xì)胞3 h相比，唾液乳桿菌作用細(xì)胞6 h和24 h時(shí)其黏附數(shù)分別增加了23%和15%；與嗜酸乳桿菌作用3 h相比，嗜酸乳桿菌作用細(xì)胞6 h和24 h時(shí)其黏附數(shù)分別增加了18%和13%。與乳酸桿菌作用3 h相比，三株乳酸桿菌作用細(xì)胞6 h和24 h時(shí)其黏附數(shù)均顯著增加，并且以乳酸桿菌作用6 h時(shí)的黏附數(shù)為最多。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，三株乳酸桿菌對(duì)IPECJ2細(xì)胞具有很好的黏附性，其中植物乳桿菌黏附性較好。

表4 三株乳酸桿菌黏附能力測(cè)定的結(jié)果log cfu/mL

2.5 乳酸桿菌對(duì)大腸桿菌黏附豬小腸上皮細(xì)胞的影響 乳酸桿菌對(duì)大腸桿菌黏附豬腸上皮細(xì)胞的影響結(jié)果如表5所示，與大腸桿菌刺激細(xì)胞0 min相比，大腸桿菌刺激細(xì)胞3、6 h和24 h時(shí)植物乳桿菌對(duì)其黏附數(shù)分別降低了16%、19%和6%，唾液乳桿菌對(duì)其黏附數(shù)分別降低了6%、16%和3%，嗜酸乳桿菌對(duì)其黏附數(shù)分別降低了4%、12%和3%，并且均以大腸桿菌刺激細(xì)胞6 h時(shí)三株乳酸桿菌對(duì)其黏附數(shù)降低為最多。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，三株乳酸桿菌能夠有效抑制大腸桿菌黏附豬小腸上皮細(xì)胞，其抑制能力強(qiáng)弱依次是植物乳桿菌、唾液乳桿菌和嗜酸乳桿菌。

表5 三株乳酸桿菌對(duì)大腸桿菌黏附豬小腸上皮細(xì)胞測(cè)定的結(jié)果log cfu/mL

3 討論

3.1 三株乳酸桿菌抑菌能力 腸道微生物構(gòu)成的屏障是腸道屏障的重要組成部分，對(duì)宿主腸道功能的發(fā)揮具有重要作用。乳酸桿菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的乳酸、抗菌肽等有益物質(zhì)，可顯著降低環(huán)境pH和氧化還原點(diǎn)位值，使腸內(nèi)酸度增高，一方面促使主細(xì)胞分泌的胃蛋白酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槲傅鞍酌?，還能提高胃蛋白酶活性，促進(jìn)動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收，從而提高飼料報(bào)酬、改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能；另一方面能夠抑制和殺滅革蘭氏陰性菌、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性細(xì)菌、大腸桿菌類(lèi)和沙門(mén)氏菌等病原菌，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡（黃奕雯等，2017；陳大衛(wèi)等，2014）。由此可見(jiàn)，乳酸菌對(duì)于提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和健康水平具有十分重要的意義。本研究分別采用牛津杯法和活菌計(jì)數(shù)法分析獲得的三株乳酸桿菌的抑菌活性，結(jié)果表明三株乳酸桿菌對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌具有很強(qiáng)的抑制作用，并且植物乳桿菌的抑菌能力明顯高于唾液乳桿菌和嗜酸乳桿菌，這與楊紅亞等（2013）和侯穎等（2017）報(bào)道一致，然而三株乳酸桿菌飼喂仔豬后能否有效抵抗大腸桿菌的感染還需要深入研究。研究表明，嗜酸乳桿菌飼喂仔豬后降低了直腸內(nèi)容物中大腸桿菌的數(shù)量，增加了乳酸桿菌的數(shù)量（Qiao等，2015）。但也有研究結(jié)果表明，乳酸桿菌的加入并沒(méi)有本試驗(yàn)抑菌效果明顯（杜金城等，2016），與本研究結(jié)果有差異，這可能是由于菌株不同、產(chǎn)酸能力不同以及抑制的病原菌不同等因素造成的差異。仔豬腸道除了面臨致病性大腸桿菌入侵的威脅外，還要面臨其他病原菌如沙門(mén)氏菌、鏈球菌、巴氏桿菌和丹毒桿菌等的威脅，因此，這三株乳酸菌對(duì)其他腸道病原菌的生長(zhǎng)繁殖是否具有抑制作用還有待進(jìn)一步研究。

3.2 三株乳酸桿菌黏附及競(jìng)爭(zhēng)性黏附能力 乳酸桿菌發(fā)揮作用的關(guān)鍵是首先定植到細(xì)胞上，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)及黏附部位阻擋病原菌與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，或者黏附細(xì)胞后細(xì)胞釋放活性抑菌物質(zhì)抑制病原菌黏附來(lái)調(diào)節(jié)豬腸道內(nèi)菌群平衡，提高仔豬健康水平。由于在體內(nèi)很難量化菌株對(duì)細(xì)胞的黏附，應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)方法來(lái)反映菌株的黏附性能已成為公認(rèn)的模式（García-Ruiz等，2014；Valeriano 等，2014）。本試驗(yàn)選用豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）為模型，用分離的乳酸桿菌作用細(xì)胞后檢測(cè)其黏附性。結(jié)果表明，三株乳酸桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞均具有一定的黏附性，其中植物乳桿菌黏附性較好，這與Wang等（2017）的結(jié)果相一致。同時(shí)乳酸桿菌作用IPEC-J2細(xì)胞24 h時(shí)，其黏附細(xì)胞的能力均下降，這可能是由于培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物用盡，或者是細(xì)菌表面與細(xì)胞膜外糖脂共價(jià)結(jié)合的膜磷壁酸減少，或者是細(xì)胞表面黏附受體達(dá)到飽和所引起的黏附力下降（趙靜等，2014），這一結(jié)果與吳凡等（2015）及劉海鴻等（2017）在乳酸桿菌作用細(xì)胞后2 h和4 h時(shí)黏附力開(kāi)始下降有所不同，這可能是由于生長(zhǎng)環(huán)境、菌株和細(xì)胞等的不同引起的差異，也可能是由于不同菌株在不同生長(zhǎng)階段代謝產(chǎn)物不同所引起的黏附效果不同（向鑫玲等，2016）。在分析乳酸桿菌對(duì)大腸桿菌黏附豬小腸上皮細(xì)胞的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，三株乳酸桿菌與對(duì)照組相比均具有顯著抑制大腸桿菌黏附細(xì)胞的特性，這是由于乳酸桿菌黏附細(xì)胞后競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)及黏附部位阻擋了大腸桿菌與細(xì)胞表面受體的結(jié)合。然而當(dāng)大腸桿菌刺激時(shí)間達(dá)24 h時(shí)，乳酸桿菌抑制大腸桿菌黏附細(xì)胞的能力下降，這可能是由于大腸桿菌釋放的內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒性作用，影響了細(xì)胞正常的生理功能。

綜上所述，分離的三株乳酸桿菌對(duì)豬腸上皮細(xì)胞具有良好的黏附能力，并可抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的生長(zhǎng)和黏附豬小腸上皮細(xì)胞，為其在仔豬飼糧中的應(yīng)用提供了依據(jù)，為深入研究乳酸桿菌調(diào)節(jié)仔豬腸道屏障功能奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從健康豬糞便中分離鑒定出三株乳酸桿菌分別是植物乳桿菌、唾液乳桿菌和嗜酸乳桿菌，三株乳酸桿菌能夠有效抑制致病性大腸桿菌的生長(zhǎng)，具有黏附豬小腸上皮細(xì)胞的特性，并能夠有效抑制致病性大腸桿菌黏附于豬小腸上皮細(xì)胞。

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