梁晶晶 ，鄭衛(wèi)衛(wèi) ，趙 碩 ，張大偉 ，2*

（1.青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司，山東青島 266111；2.齊魯工業(yè)大學(xué)，山東濟(jì)南 250353）

芽孢桿菌在動(dòng)物上應(yīng)用主要依賴(lài)其在腸道或環(huán)境中繁殖分泌消化酶、維生素或抗菌物質(zhì)而達(dá)到益生的功能。同一菌株在不同生長(zhǎng)環(huán)境中繁殖和分泌產(chǎn)物能力有很大差異，不同菌株之間的生長(zhǎng)潛力和分泌產(chǎn)物類(lèi)別同樣有較大差異。本文主要探究枯草與解淀粉芽孢桿菌的生理生化指標(biāo)差異，及枯草、地衣與解淀粉芽孢桿菌低溫生長(zhǎng)和平板上的產(chǎn)酶比較，以期探尋三類(lèi)芽孢之間性能差異的規(guī)律，為其在動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用方案提供菌株性能基礎(chǔ)數(shù)據(jù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 菌種 芽孢桿菌菌種來(lái)源見(jiàn)表1。

1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：取33 g營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉(北京陸橋)溶于1 L蒸餾水中，121℃滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH為7.0，用蒸餾水定容至1 L，121℃滅菌30 min。

表1 評(píng)估的芽孢桿菌菌種來(lái)源

酪素培養(yǎng)基：干酪素10 g，酵母膏1 g，瓊脂20 g，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH為7.0，用蒸餾水定容至1 L，121℃滅菌30 min。

淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉2 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH為7.2，用蒸餾水定容至1 L，121℃滅菌30 min。

1.3 染色液 酸性汞試劑：HgCl215 g，濃HCl 20 mL，加蒸餾水至100 mL。

盧哥氏碘液：碘片1 g，碘化鉀2 g。先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀中，待碘全溶后，加蒸餾水至300 mL。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 生理生化指標(biāo)測(cè)定 將枯草芽孢桿菌1號(hào)和3號(hào)、解淀粉芽孢桿菌1號(hào)進(jìn)行7%氯化鈉生長(zhǎng)、V-P測(cè)定、硝酸鹽還原、D-甘露醇發(fā)酵、丙酸鹽利用試驗(yàn)，方法參考《GB/T 26428-2010飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)》。

1.4.2 生長(zhǎng)曲線制作 從-80℃冰箱取出保種甘油管，用接種環(huán)挑取一環(huán)菌液，采用劃線法接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。從平板上挑取一環(huán)菌苔，接種到盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，作為種子。

將種子液按3%接種量接種到盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基中，15℃或28℃、200 r/min連續(xù)培養(yǎng)24～80 h，每隔4～8 h在超凈工作臺(tái)進(jìn)行取樣，采用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處吸光值，如菌液過(guò)濃，用純凈水進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)庵悼刂圃?.3～0.6，用相應(yīng)稀釋倍數(shù)的LB培養(yǎng)基作為對(duì)照。以培養(yǎng)時(shí)間t為橫坐標(biāo)，吸光值OD600為縱坐標(biāo)，制作生長(zhǎng)曲線圖。

1.4.3 產(chǎn)酶性能測(cè)定 使用滅菌牙簽挑取平板上的單菌落，分別點(diǎn)種在酪素培養(yǎng)基和淀粉培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

通過(guò)酪素培養(yǎng)基觀察產(chǎn)蛋白酶的能力，該培養(yǎng)基一般呈乳白色，菌株生長(zhǎng)中產(chǎn)蛋白酶后菌落周?chē)虻鞍妆环纸?，乳白色褪掉而呈現(xiàn)透明，肉眼初步觀察可見(jiàn)隱約的透明圈，在菌落周?chē)渭舆m量酸性汞試劑后，未被降解的蛋白遇酸性汞試劑變性，培養(yǎng)基底色白色加重，透明圈會(huì)更加明顯，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落及透明圈直徑的大小。

通過(guò)淀粉培養(yǎng)基觀察產(chǎn)淀粉酶的能力，該培養(yǎng)基一般無(wú)色透明，滴加盧哥氏碘液，輕搖平皿，使碘液鋪滿培養(yǎng)基表面，等待片刻，培養(yǎng)基中未被降解的淀粉遇碘變藍(lán)，菌落周?chē)矸郾唤到獾牡牡胤匠霈F(xiàn)透明圈，同樣采用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落及透明圈直徑的大小。

酶活力大小采用透明圈與菌落直徑的比值表示，比值越大，表示該芽孢桿菌產(chǎn)酶的活力越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草1號(hào)、枯草3號(hào)和解淀粉1號(hào)三株菌都可在7%氯化鈉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。V-P測(cè)定三株芽孢桿菌都為陽(yáng)性，枯草3顏色最深。硝酸鹽還原測(cè)定中三株菌菌液濃度都較濃，紅色不易觀察，將發(fā)酵液稀釋十倍后紅色更明顯，觀察更方便，結(jié)果顯示三株菌均為硝酸鹽還原陽(yáng)性。發(fā)酵D-甘露醇產(chǎn)酸驗(yàn)證試驗(yàn)表明，三株菌都可發(fā)酵D-甘露醇產(chǎn)酸使培養(yǎng)基變黃。試驗(yàn)中將三株芽孢桿菌接種在丙酸鹽培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后其顏色均為深綠色，與對(duì)照組無(wú)顯著差異，說(shuō)明三株菌都不能利用丙酸鹽。

2.2 生長(zhǎng)曲線

2.2.1 15℃生長(zhǎng)曲線 試驗(yàn)測(cè)定了芽孢桿菌在低溫（15℃）下生長(zhǎng)情況，每隔8 h取樣測(cè)定吸光值，共培養(yǎng)80 h。試驗(yàn)表明，兩株解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌1號(hào)在低溫條件下生長(zhǎng)好于其余兩株枯草和地衣芽孢桿菌。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，枯草芽孢桿菌1號(hào)的生物量最大，在72 h OD600達(dá)到8.0，兩株解淀粉芽孢桿菌最高OD600也出現(xiàn)在48 h以后，最高值為3.8～4.4?？莶菅挎邨U菌2號(hào)和3號(hào)在15℃下生長(zhǎng)情況較差，48 h后才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而兩株地衣芽孢桿菌生物量80 h內(nèi)一直低于1.0。綜上，試驗(yàn)中兩株解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌1號(hào)相較于其他四株芽孢桿菌更能耐受低溫，較適宜在低溫水產(chǎn)養(yǎng)殖水體應(yīng)用（圖1和圖2）。

圖1 枯草芽孢桿菌15℃生長(zhǎng)曲線

圖2 地衣和解淀粉芽孢桿菌15℃生長(zhǎng)曲線

2.2.2 28℃生長(zhǎng)曲線 芽孢桿菌在28℃下生長(zhǎng)較為迅速，所評(píng)估的7株芽孢桿菌都在4 h內(nèi)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，24 h即可到達(dá)穩(wěn)定期，生長(zhǎng)明顯快于低溫下。但研究表明，枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌28℃下最高OD600值均低于15℃，因此，同一株菌28℃時(shí)最高生物量不一定高于15℃。地衣芽孢桿菌在低溫下生長(zhǎng)最差的狀態(tài)，在28℃下長(zhǎng)勢(shì)甚至好于解淀粉芽孢桿菌和部分枯草芽孢桿菌（圖3和圖4）。

圖3 枯草芽孢桿菌28℃生長(zhǎng)曲線

圖4 地衣和解淀粉芽孢桿菌28℃生長(zhǎng)曲線

2.3 產(chǎn)酶性能測(cè)定結(jié)果 試驗(yàn)表明，這7株芽孢桿菌都能在酪素培養(yǎng)基以及淀粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并分解蛋白或淀粉，加入相應(yīng)指示劑后出現(xiàn)透明圈。通過(guò)透明圈與菌落直徑比值可知，這7株芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力由大到小排序?yàn)椋航獾矸?＞解淀粉1＞枯草2＞枯草3＞地衣1＞地衣 2＞枯草1；產(chǎn)淀粉酶能力大小排序?yàn)椋航獾矸?＞枯草3＞解淀粉1＞枯草1＞枯草2＞地衣2＞地衣1?？梢园l(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌2號(hào)產(chǎn)兩種胞外酶能力最強(qiáng)，兩株地衣芽孢桿菌產(chǎn)酶能力不占優(yōu)勢(shì)（表2）。

表2 芽孢桿菌產(chǎn)酶能力測(cè)定結(jié)果

3 討論

研究表明，枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌16S rDNA同源性較高，通過(guò)簡(jiǎn)單的測(cè)序鑒定也無(wú)法準(zhǔn)確確定種屬，需通過(guò)特性基因進(jìn)行分析確定。盧娟等（2013）利用基因yyaR、tetB在解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌中排列順序的差異，利用引物yyaR-F/tetB-R對(duì)疑似解淀粉芽孢桿菌菌株進(jìn)行了分類(lèi)鑒定。湯際亮等（2013）根據(jù)生理、生化反應(yīng)和菌株gyrB基因序列鑒定了枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，表明試驗(yàn)獺兔個(gè)體盲腸中解淀粉芽孢桿菌的數(shù)量多于枯草芽孢桿菌。劉勇等（2010）根據(jù)枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌基因組中β-甘露聚糖酶基因(gmuG或ydhT)上下游序列，設(shè)計(jì)了特異引物，通過(guò)特異PCR方法對(duì)33株枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行有效的鑒定區(qū)分。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)簡(jiǎn)單生理生化指標(biāo)無(wú)法區(qū)分枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，與董靖等（2016）的結(jié)論一致，表明在解淀粉芽孢桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)中需結(jié)合特性基因進(jìn)行亞種鑒定。

生長(zhǎng)曲線是描述生物生長(zhǎng)繁殖變化的曲線（王宏偉，1994），其可反映細(xì)菌在不同的培養(yǎng)條件下所表現(xiàn)出的生長(zhǎng)規(guī)律和繁殖特點(diǎn)，細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的繪制方法有很多，有血細(xì)胞計(jì)數(shù)法、活菌計(jì)數(shù)法、稱(chēng)重法、分光光度法等。在嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件的前提下，可通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的OD值判斷細(xì)菌是否進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及細(xì)菌生物量變化（何嵐等，2017）。本研究結(jié)果顯示，溫度對(duì)芽孢桿菌的繁殖影響很大，28℃時(shí)4 h內(nèi)即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，15℃時(shí)24 h后才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；同一溫度下三種菌之間及不同亞株之間生長(zhǎng)情況差異顯著 （P≤0.05）；研究發(fā)現(xiàn)15℃生長(zhǎng)不好的地衣芽孢桿菌在28℃下卻生長(zhǎng)較好，所評(píng)估的所有枯草和解淀粉芽孢桿菌28℃時(shí)最高生物量均低于15℃。綜上說(shuō)明，要在某一特定動(dòng)物或環(huán)境飼喂或使用芽孢桿菌制劑，需提前對(duì)其生長(zhǎng)繁殖規(guī)律進(jìn)行探究，以免因環(huán)境不適宜造成繁殖較差而起不到效果。此外，在15℃下應(yīng)用芽孢桿菌可加大使用量，縮短其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間，但一旦繁殖起來(lái)，投加頻率卻不一定比溫度高時(shí)頻繁。

產(chǎn)生多種酶、促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)的消化吸收是益生芽孢桿菌發(fā)揮益生作用的機(jī)制之一，有研究表明，枯草芽孢桿菌對(duì)動(dòng)物日糧的消化效果明顯優(yōu)于地衣芽孢桿菌（陶榮霞，2012）。對(duì)芽孢桿菌產(chǎn)酶特性的研究可采用模擬消化法（劉秀俠等，2017；程德勇等，2014）和平板透明圈法（程德勇等，2014；徐良玉，2003）。本文采用平板透明圈法比較了待測(cè)芽孢桿菌的產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶能力，結(jié)果顯示在產(chǎn)酶方面除枯草3號(hào)的產(chǎn)淀粉酶能力較突出外，參與測(cè)試的其他枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌產(chǎn)兩種酶能力相近，均不及解淀粉芽孢桿菌。本研究以酪素作為蛋白、以可溶性淀粉（α-淀粉）作為淀粉進(jìn)行分解蛋白和淀粉性能評(píng)估，結(jié)果表明解淀粉芽孢桿菌性能最優(yōu)，但因不同飼料原料所含蛋白、淀粉的種類(lèi)不同，對(duì)具體原料的分解效果需進(jìn)一步進(jìn)行評(píng)估。

[1]程德勇，繆禮鴻.高產(chǎn)蛋白酶活性的枯草芽孢桿菌篩選及鑒定[J].武漢輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，33（1）：6 ～ 10.

[2]董靖，阮晶，胥寧，等.飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，38（4）：410 ～ 415.

[3]何嵐，王柳懿，朱琪，等.兩種繪制枯草芽孢桿菌和大腸桿菌生長(zhǎng)曲線方法的比較[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，23（5）：14 ～ 18.

[4]劉秀俠，徐海燕，辛國(guó)芹，等.1株枯草芽孢桿菌益生特性研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2017，44（8）：2333 ～ 2341.

[5]劉勇，李輝，李金霞，等.特異PCR 方法對(duì)枯草芽孢桿菌群的鑒定區(qū)分[J].飼料工業(yè)，2010，31（4）：52 ～ 54.

[6]劉天貴，胡尚勤.不同基質(zhì)對(duì)地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的影響[J].重慶師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1998，15（4）：21 ～ 23.

[7]盧娟，夏啟玉，顧文亮，等.拮抗香蕉枯萎病菌的解淀粉芽孢桿菌LX1菌株的鑒定及其抗菌蛋白基因的克隆[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2013，34（1）：117 ～ 124.

[8]仝永娟，薩仁娜，張宏福，等.三株芽孢桿菌抑菌活性分析及對(duì)肉雞舍空氣微生物的影響 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（20）：4344～4353.

[9]湯際亮，張煜坤，孫得發(fā)，等.獺兔盲腸中枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定[J].《黑龍江畜牧獸醫(yī)》科技版，2013，10月（上）：149 ～ 151.

[10]陶榮霞.17株芽孢桿菌產(chǎn)酶特性及益生特性的研究：[碩士畢業(yè)論文][D].中國(guó)武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[11]王宏偉.生長(zhǎng)曲線預(yù)測(cè)新模型[J].中州大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，2：74～78.

[12]徐良玉，石貴陽(yáng)，陶飛，等.快速篩選耐酸性α-淀粉酶生產(chǎn)菌株的平板透明圈法[J].無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，23（5）：92 ～ 94.

[13]中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 26428-2010.飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011-1-14.