孔祥瑞，李 靜，周 林，肖 漓，石炳毅

西羅莫司(SRL)具有免疫抑制、抗腫瘤、抗真菌的多重作用，被廣泛應用于實體器官移植[1-2]，尤其是對惡性腫瘤受者，雖取得較好的臨床療效，但卻常因黏膜潰瘍、高膽固醇和甘油三酯血癥、高血壓以及由于骨髓抑制增加感染和淋巴瘤的風險，使其應用受到限制[3]。近年來，雖然發(fā)現(xiàn)SRL治療可引起嚴重的骨髓抑制、血小板減少以及肺炎，但仍有較多的研究證實肝移植后肝癌患者轉(zhuǎn)換mTORi免疫抑制方案有助于腫瘤復發(fā)的防治[4-5]。本研究在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，不同藥物劑型、劑量和給藥方式的不良反應差異明顯，且對大鼠的生存有較大影響，對SRL在動物實驗中應用及臨床用藥有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物：SPF級雄性SD大鼠60只，體重200～220 g，均購于解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，許可證：SCXK-(軍)2012-004。

1.1.2試驗試劑：西羅莫司片劑(美國惠氏制藥有限公司)由海正輝瑞制藥有限公司惠贈，西羅莫司口服液由杭州中美華東制藥有限公司惠贈，緩釋劑牛膠原蛋白活性肽由北京紫霞環(huán)保生物工程技術(shù)有限公司資助。

1.2實驗設(shè)計

1.2.1實驗分組：SD雄性大鼠60只隨機分為A1組、A2組、A3組、B1組、B2組、B3組，每組10只。

1.2.2實驗干預：A1組給予SRL高劑量片劑普通灌胃、A2組給予SRL高劑量片劑緩釋灌胃、A3組給予SRL低劑量片劑緩釋灌胃、B1組給予SRL高劑量口服液普通灌胃、B2組給予SRL高劑量口服液緩釋灌胃、B3組給予SRL低劑量口服液緩釋灌胃。A1、A2、B1、B2組負荷劑量1 mg/kg，1/d；A3、B3組負荷劑量0.5 mg/kg，1/d。除A1、B1組外其余各組藥物均進行緩釋處理；實驗持續(xù)30 d。

1.2.3緩釋方案：西羅莫司片劑搗碎粉末狀，以注射用滅菌用水溶解，牛膠原蛋白活性肽溶于水溶液，終濃度為5%；西羅莫司口服液緩釋劑用牛膠原蛋白活性肽直接溶于稀釋后的西羅莫司口服液，終濃度為5%。

1.3觀察指標及方法 記錄各組大鼠的飲食情況和體重變化；詳細記錄各組大鼠的器官病變情況、死亡率以及生存時間。對死亡大鼠解剖，標本固定，拍照；試驗結(jié)束后所有存活大鼠，均麻醉狀態(tài)下處死，取材，標本固定，拍照。器官病變情況主要觀察肝臟色澤輕度為顏色略變深，重度為顏色深暗、發(fā)黑；肺臟結(jié)節(jié)病變輕度為結(jié)節(jié)<5個，中度為5～10個，重度為>10個；胃潰瘍輕度為侵犯黏膜層，中度為侵犯黏膜下層至肌層，重度為侵犯肌層及漿膜層、胃呈透明薄膜狀。

2 結(jié)果

2.1一般情況及死亡率 藥物干預后第3天開始，所有實驗組大鼠食欲有不同程度降低，以A1和B1組最為明顯，A2和B2組次之，A3和B3組變化最小，隨著實驗持續(xù)，各組大鼠飲食狀況逐漸好轉(zhuǎn)。定期監(jiān)測所有大鼠體重，直至實驗終止，各組體重變化情況，見表1。第30天，A1、A2、A3組間體重比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=7.566，P=0.002)；B1、B2、B3組間體重比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=25.481，P<0.001)。第30天，A1組與B1組、A2組與B2組、A3組與B3組體重比較差異均無統(tǒng)計學意義(t=-1.736、-0.674、-1.927，P=0.100、0.509、0.070)。從第5天開始，實驗大鼠出現(xiàn)死亡；至第30天時，A1、A2、A3、B1、B2、B3組分別死亡10只(100%)、6只(60%)、1只(10%)、8只(80%)、3只(30%)、0只。A1組死亡率高于A2組(χ2=5.000，P=0.025)，A2組死亡率高于A3組(χ2=5.494，P=0.019)。B1組死亡率顯著高于B2組(χ2=5.051，P=0.025)，但B2組與B3組比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.529，P=0.06)。A1組與B1組、A2組與B2組、A3組與B3組死亡率比較差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=2.222、1.818、1.053，P=0.136、0.074、0.136)。

2.2器官病變情況 對各組大鼠進行解剖發(fā)現(xiàn)，在負荷劑量、劑型不同的情況下，各組大鼠肝、肺、胃、腎、小腸等臟器出現(xiàn)輕重不同的病變；且與高負荷劑量組相比，低負荷劑量組大鼠肝、肺、胃臟器的病變明顯減少，病變程度輕。見表2。

2.3生存時間比較 各組最短生存時間為5 d，最長生存時間30 d(至實驗終止時)。對各組生存時間進行Kaplan-Meier分析，采用log-rank法進行比較，統(tǒng)計結(jié)果顯示，低負荷劑量組具有良好生存效益，生存時間顯著延長，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖1。

表1 6組大鼠各實驗階段的體重變化情況

注：A1組西羅莫司片劑普通灌胃，A2組西羅莫司片劑緩釋灌胃，A3組西羅莫司片劑緩釋灌胃，B1組西羅莫司口服液普通灌胃，B2組西羅莫司口服液緩釋灌胃，B3組西羅莫司口服液緩釋灌胃；第30天A1、A2、A3組間比較，F(xiàn)=7.566，P=0.002；第30天B1、B2、B3組間比較，F(xiàn)=25.481，P<0.001

表2 6組大鼠的器官病變情況(只)

注：A1組西羅莫司片劑普通灌胃，A2組西羅莫司片劑緩釋灌胃，A3組西羅莫司片劑緩釋灌胃，B1組西羅莫司口服液普通灌胃，B2組西羅莫司口服液緩釋灌胃，B3組西羅莫司口服液緩釋灌胃

圖16組大鼠的生存時間比較

A1組西羅莫司片劑普通灌胃(1 mg/kg)，A2組西羅莫司片劑緩釋灌胃(1 mg/kg)，A3組西羅莫司片劑緩釋灌胃(0.5 mg/kg)，B1組西羅莫司口服液普通灌胃(1 mg/kg)，B2組西羅莫司口服液緩釋灌胃(1 mg/kg)，B3組西羅莫司口服液緩釋灌胃(0.5 mg/kg)

3 討論

SRL又稱雷帕霉素于1999年開始用于治療器官移植排斥反應，與普樂可復(FK506)的結(jié)構(gòu)相似，但免疫抑制機制卻截然不同，F(xiàn)K506抑制T淋巴細胞由G0期至G1期的增殖[6]；而SRL則通過不同的細胞因子受體阻斷信號傳導，阻斷T淋巴細胞及其他細胞由G1期至S期的進程。與FK506相比，SRL可阻斷T淋巴細胞和B淋巴細胞的鈣依賴性和非鈣依賴性信號傳導通路，抑制機體的免疫反應[7]。動物實驗及臨床應用表明，SRL是一種免疫抑制作用良好，毒性較低，基本無腎毒性的新型免疫抑制劑[8]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，SRL治療可引起高脂血癥、嚴重的骨髓抑制、血小板減少以及肺炎等不良反應[9]。然而有越來越多的研究表明，在器官移植后SRL替代鈣調(diào)磷酸酶抑制劑類藥物可以明顯減少這類藥物的腎毒性和神經(jīng)毒性[10-12]，尤其有助于惡性腫瘤患者移植術(shù)后腫瘤復發(fā)的防治。近年來的研究結(jié)果顯示，SRL在保護移植物的同時還可以抑制腫瘤的生長[13]。

有研究在以SRL為基礎(chǔ)方案的預防肝移植術(shù)后腫瘤復發(fā)的臨床治療中發(fā)現(xiàn)，因服藥方式的不同，部分患者出現(xiàn)難治性黏膜潰瘍(口腔潰瘍、胃潰瘍)，在單用SRL超劑量時部分患者會出現(xiàn)較嚴重間質(zhì)性肺炎、骨髓抑制及血小板降低等[5]。在早期動物實驗中，SRL負荷劑量以文獻報道的1 mg/kg為標準干預量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物毒性作用明顯，尤其黏膜潰瘍及難治性肺炎，多數(shù)研究對象在短期內(nèi)出現(xiàn)明顯體重減輕及死亡。本研究是基于以上問題而設(shè)計，旨在探索合適的負荷劑量及干預方式，為動物實驗提供合適的藥物劑量參考。

本研究發(fā)現(xiàn)，在高負荷劑量(1 mg/kg)及干預方式相同情況下(A1組與B1組、A2組與B2組)，雖然SRL片劑與口服液毒性作用無明顯組間差異，但二者所產(chǎn)生的毒性作用嚴重且致死率較高，說明在高負荷劑量時，無論采取何種干預方式，片劑和口服液均有較大的毒性作用。然而對同一劑型在負荷劑量相同情況下采用不同干預方式發(fā)現(xiàn)(A1組與A2組；B1組與B2組)，雖然藥物毒性作用依然顯著，半數(shù)致死量大，但組內(nèi)差異顯著，提示藥物緩釋技術(shù)有助于減輕SRL嚴重毒性作用。低負荷劑量(0.5 mg/kg)干預時，不同劑型組間死亡率和生存時間比較，差異無顯著性意義，與高負荷劑量相比，不同劑型組內(nèi)差異顯著。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，低負荷劑量緩釋SRL藥物干預對大鼠體重增加、生存時間延長有明顯的促進作用。

既往文獻報道，SRL干預劑量為1 mg/kg時，經(jīng)反復試驗驗證毒副作用明顯，且耐受性差[14]。本研究認為雖然劑型不同，但低負荷劑量緩釋SRL耐受性良好，毒性作用小，與高負荷劑量SRL干預相比，具有良好的生存效益，因而建議在動物實驗中采用低負荷劑量緩釋SRL的干預方式，以減輕因劑量及給藥不同所產(chǎn)生的毒性作用。

本研究結(jié)果顯示，在動物基礎(chǔ)藥效研究中，SRL口服液比片劑更容易使用，緩釋藥液容易制備，且濃度均一，并可節(jié)約實驗成本。臨床治療中，雖然沒有明確的界定，但因片劑的方便性，目前廣泛應用，在藥物口服過程中，包裹緩釋空膠囊是較好的選擇，并可能實現(xiàn)藥效持續(xù)釋放。至于緩釋技術(shù)是否能提高藥物的吸收及藥效，還需要進一步研究進行證實。本研究受樣本量和實驗時間影響具有一定的局限性，需要更大樣本量、長時間隨訪結(jié)果來進一步證實低負荷劑量緩釋SRL干預的效益，亦需要相關(guān)臨床研究證實緩釋技術(shù)對藥效的影響。

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