賈利剛，褚兆蘋，田 菲，韓 華，代聰偉，王 蓓，張 媛

(河北省人民醫(yī)院婦科,石家莊 050051)

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，雖然近年來隨著宮頸細(xì)胞學(xué)篩查技術(shù)的不斷提高，發(fā)病率及病死率有所降低，但患者呈年輕化趨勢[1-3]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族是一類與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、應(yīng)激反應(yīng)等密切相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)，p38 MAPK，c-Jun氨基末端激酶(JNK)3個(gè)亞族[4-6]。研究顯示MAPK信號通路在眾多實(shí)體腫瘤中被高度激活，抑制此信號通路的活化成為多種抗腫瘤藥物的靶點(diǎn)之一[4-6]。西羅莫司是從復(fù)活島上發(fā)現(xiàn)的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，動(dòng)物藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)西羅莫司是一種低毒、高效、無腎毒性的新型免疫性抑制劑，被廣泛地應(yīng)用于腎移植中[7-8]。另外研究還顯示西羅莫司能夠通過抑制其靶蛋白mTOR表達(dá)進(jìn)而調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮對卵巢癌、乳腺癌、肝癌、腎癌、宮頸癌等腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[9-13]，而西羅莫司是否能夠通過抑制MAPK信號通路進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤作用尚未見報(bào)道，因此本研究將旨在探討西羅莫司能否通過MAPK信號通路抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 宮頸癌細(xì)胞Hela購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司；兔抗人Bax、Bcl-2、Cyclin D1、p21、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK及GAPDH多克隆抗體均購于美國Abcam公司；Annexin V-FITC/PI流式雙染試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒，細(xì)胞周期檢測試劑盒、SB203580(ERK1/2抑制劑)、SP600125(JNK抑制劑)、PD98059(p38 MAPK抑制劑)均購于南通碧云天生物技術(shù)有限公司。ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；MK3酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.3細(xì)胞分組 (1)將0、10、30、100 nmol/L的西羅莫司作用于Hela細(xì)胞，為0、10、30、100 nmol/L組；(2)將細(xì)胞分為正常對照組(無任何藥物處理)，西羅莫司組(30 nmol/L西羅莫司)，西羅莫司+SB203580組(30 nmol/L西羅莫司+10 μmol/L SB203580)，西羅莫司+SP600125(30 nmol/L西羅莫司+10 μmol/L SP600125)，西羅莫司+PD98059(30 nmol/L西羅莫司+10 μmol/L PD98059)。

1.4四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測Hela細(xì)胞活力 將5×103個(gè)Hela細(xì)胞接種到6孔板，待細(xì)胞貼壁后，按“1.3(1)”分組，并將細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h，加入MTT孵育4 h后再加入150 μL的二甲基亞砜，震蕩使結(jié)晶物溶解，測定吸光度(A)。

1.5Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡 將9×103個(gè)Hela細(xì)胞接種到6孔板，待細(xì)胞貼壁后，按“1.3(1)”分組，并將細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，加入結(jié)合緩沖液混勻后，繼續(xù)加入Annexin V-FITC及PI并混勻，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測并分析。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 將9×103個(gè)Hela細(xì)胞接種到6孔板，待細(xì)胞貼壁后，按“1.3(1)”分組，并將細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，加入核糖核酸酶(RNase)混勻并孵育1 h，再加入PI染液孵育30 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期的檢測并分析。

1.7Western blot 將9×103個(gè)Hela細(xì)胞接種到6孔板，待細(xì)胞貼壁后，按“1.3(2)”分組，并將細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞并裂解得到細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度。制作濃縮膠和分離膠，蛋白上樣后，進(jìn)行凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂奶粉封閉1 h后，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

2 結(jié) 果

2.1西羅莫司對Hela細(xì)胞活力的影響 0、10、30、100 nmol/L西羅莫司作用Hela細(xì)胞24、48、72 h，西羅莫司呈時(shí)間及濃度依賴性地降低細(xì)胞活力(P<0.01)，見表1。

表1 西羅莫司對Hela細(xì)胞活力的影響

2.2西羅莫司對Hela細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響 0、10、30、100 nmol/L西羅莫司作用Hela細(xì)胞48 h，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，與0 nmol/L組比較，10、30、100 nmol/L組細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率均顯著提高(均P<0.05)，并使細(xì)胞周期阻滯在G1期(均P<0.01)，見表2。

表2 西羅莫司對Hela細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響

a:P<0.01，與同時(shí)間點(diǎn)0 nmol/L組比較

2.3西羅莫司對Hela細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Cyclin D1及p21表達(dá)的影響 0、10、30、100 nmol/L的西羅莫司作用Hela細(xì)胞48 h，與0 nmol/L組比較，10、30、100 nmol/L組細(xì)胞中Cyclin D1、Bcl-2相對表達(dá)水平下調(diào)(P<0.01)，Bax及p21的相對表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)。見表3。

表3 西羅莫司對Hela細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Cyclin D1及p21表達(dá)的影響

a:P<0.01，與0 nmol/L組比較

2.4西羅莫司對Hela細(xì)胞中ERK1/2、JNK及p38 MAPK磷酸化水平的影響 0、10、30、100 nmol/L的西羅莫司作用Hela細(xì)胞48 h，與0 nmol/L組比較，10、30、100 nmol/L組細(xì)胞中p-ERK1/2、p-JNK及p-p38 MAPK相對表達(dá)水平下調(diào)(P<0.01)，見表4。

2.5阻斷ERK1/2、JNK及p38 MAPK信號通路對西羅莫司處理的Hela細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Cyclin D1及p21表達(dá)的影響 與西羅莫司組比較，西羅莫司+SB203580組、西羅莫司+SP600125、西羅莫司+PD98059組細(xì)胞中Bax及p21相對表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)，Bcl-2及Cyclin D1相對表達(dá)水平下調(diào)(P<0.01)。見表5。

表4 西羅莫司對Hela細(xì)胞中ERK1/2及p38 MAPK磷酸化水平的影響

a:P<0.01，與0 nmol/L組比較

2.6阻斷ERK1/2、JNK及p38 MAPK信號通路對西羅莫司處理的Hela細(xì)胞中MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與西羅莫司組比較，西羅莫司+SB203580組、西羅莫司+SP600125、西羅莫司+PD98059組細(xì)胞中p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 MAPK相對表達(dá)水平下調(diào)(P<0.01)。見表6。

表5 阻斷ERK1/2、JNK及p38 MAPK信號通路對西羅莫司處理的Hela細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Cyclin D1及p21表達(dá)的影響

a:P<0.01，與正常對照組比較;b:P<0.01，與西羅莫司組比較

表6 阻斷ERK1/2、JNK及p38 MAPK信號通路對西羅莫司處理的Hela細(xì)胞中MAPK信號通路相關(guān)蛋白的影響

a:P<0.01，與正常對照組比較;b:P<0.01，與西羅莫司組比較

3 討 論

西羅莫司是1964年從復(fù)活島上發(fā)現(xiàn)的一種新型抗生素，接著研究者還發(fā)現(xiàn)西羅莫司具有抗酵母菌感染作用，提示西羅莫司的免疫抑制作用[7-8]。后續(xù)眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)西羅莫司還具有顯著的抗腫瘤作用[9-12]。本課題組前期已經(jīng)證實(shí)西羅莫司能顯著抑制Hela細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移[13]，但西羅莫司對Hela細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)機(jī)制尚報(bào)道較少。所以本研究首先采用MTT法檢測不同濃度的西羅莫司對Hela細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明西羅莫司能顯著降低Hela細(xì)胞活力，并呈時(shí)間及濃度依賴性。接著采用流式細(xì)胞術(shù)檢測西羅莫司對Hela細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明西羅莫司能顯著提高細(xì)胞凋亡率，并使細(xì)胞周期阻滯于G1期。

細(xì)胞的凋亡受細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白調(diào)控，Bcl-2家族中的抑制凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax結(jié)合，阻斷上游凋亡信號傳遞，促進(jìn)細(xì)胞存活與生長。而促凋亡蛋白Bax自身還能夠形成二聚體，傳遞上游凋亡信號，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡密不可分，細(xì)胞周期由細(xì)胞周期相關(guān)蛋白調(diào)控，與G1期最為密切相關(guān)的周期蛋白Cyclin D1與細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶4/6(CDK4/6)結(jié)合形成復(fù)合物，促使Rb磷酸化，誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子E2F3進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)增殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，而細(xì)胞周期蛋白抑制子p21通過抑制細(xì)胞周期蛋白與CDK4/6的結(jié)合，進(jìn)而阻斷細(xì)胞的惡性增殖[14-15]。已經(jīng)有研究顯示西羅莫司能夠通過上調(diào)Bax及p21表達(dá)，下調(diào)Bcl-2及Cyclin D1表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯于G1期[9,11-12]，推測西羅莫司可能能夠通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)使Hela細(xì)胞周期發(fā)生阻滯。本研究結(jié)果正如推測所示，西羅莫司能顯著下調(diào)Bcl-2及Cyclin D1表達(dá)，上調(diào)Bax及p21表達(dá)，繼而使細(xì)胞周期阻滯于G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

MAPK家族成員主要包括ERK、JNK及p38 MAPK等，此家族介導(dǎo)的信號通路與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞應(yīng)激行為密切相關(guān)。其中ERK共有7個(gè)亞族，ERK1及ERK2是最為重要的兩個(gè)亞族，受上游信號激活后，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，使下游轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，同時(shí)部分蛋白留在細(xì)胞質(zhì)中，共同介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、增殖、細(xì)胞骨架重排等生物學(xué)行為。JNK共有3個(gè)亞族，分別為JNK1、JNK2及JNK3，此信號通路被激活能夠激活p38 MAPK信號通路，共同介導(dǎo)細(xì)胞的增殖與應(yīng)激行為。研究顯示MAPK信號通路在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中被高度激活，并成為包括宮頸癌在內(nèi)多種腫瘤的治療靶點(diǎn)[4-6]。另外也有多個(gè)研究顯示西羅莫司對MAPK信號通路具有顯著的調(diào)控作用[16-18]。因此本研究進(jìn)一步探討西羅莫司對Hela細(xì)胞中MAPK信號通路的影響，結(jié)果表明西羅莫司能顯著的下調(diào)p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 MAPK表達(dá)。

同時(shí)為了進(jìn)一步證實(shí)西羅莫司確實(shí)是通過此信號通路抑制Hela細(xì)胞增殖，本研究還選用ERK1/2抑制劑SB203580，JNK抑制劑SP600125，p38 MAPK抑制劑PD98059分別與西羅莫司共同作用Hela細(xì)胞48 h，采用Western blot檢測西羅莫司聯(lián)合抑制劑對Hela細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Cyclin D1、p21、p-ERK1/2、p-JNK及p-p38 MAPK表達(dá)的影響，結(jié)果表明與西羅莫司組比較，西羅莫司聯(lián)合抑制劑組(SB203580、SP600125、PD98059)能顯著的下調(diào)Bcl-2，Cyclin D1表達(dá)，上調(diào)Bax及p21表達(dá)，并降低ERK1/2、JNK及p38 MAPK磷酸化水平，從而說明說明西羅莫司對Hela細(xì)胞的增殖抑制作用確實(shí)是通過阻斷MAPK信號通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，10、30、100 nmol/L的西羅莫司能顯著的降低Hela細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，下調(diào)Bcl-2，Cyclin D1表達(dá)，上調(diào)Bax及p21表達(dá)，此過程是通過阻斷MAPK信號通路實(shí)現(xiàn)的。