肖婉娜，何 敏，陳怡佳

（廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510430）

氯霉素屬抑菌性廣譜抗生素，對人體的造血系統(tǒng)有很大的毒副作用[1]。目前很多企業(yè)對該藥物殘留的檢測采用快速檢測法，難以定量。因此，試驗采用液相色譜法檢測蜂蜜中的氯霉素，并與快速檢測法進行對比。

1 試驗材料

1.1 材料

甲醇、乙腈（HPLC級）；氯霉素、乙酸乙酯、氫氧化鈉、磷酸氫二銨等，均為分析純；蜂蜜；快檢試劑盒。

1.2 儀器

島津LC-15C型、DL-360B型超聲波清洗器，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，TG16-WS型離心機等。

2 試驗方法

2.1 液相色譜檢測方法探究

2.1.1 樣品前處理方法的選擇

（1）方法1（化學(xué)法[2]）。稱10 g蜂蜜加入5 mL水混勻，再加20 mL乙酸乙酯超聲處理30 s，然后加入NaCl和NaOH超聲處理2 min后離心，移出提取液。再向殘渣中加入乙酸乙酯重復(fù)上述提取步驟，合并提取液，減壓旋干，用乙腈溶解，加MgSO4離心，上清液待測。

（2）方法2（固相萃取法[3]）。稱10 g蜂蜜加水5 mL，再加入20 mL乙酸乙酯，振蕩后離心，吸取乙酸乙酯減壓蒸干，加入5 mL水溶解殘渣，倒入活化好的固相萃取柱淋洗，再用乙酸乙酯洗脫，洗脫液吹干，用乙腈溶解待測。

2.1.2 流動相和柱溫的選擇

C18色譜柱、紫外278 nm，采用不同流動相（a.40%甲醇-0.2%磷酸氫二銨；b.30%乙腈-水；c.30%甲醇-水）和不同柱溫（室溫，30，40，50，60℃）進行采集。

2.1.3 陰性對照

取流動相進樣，再取不同濃度氯霉素溶液做峰增高法定性。

2.2 方法驗證

2.2.1 線性關(guān)系

配制1 mg/mL氯霉素甲醇儲備液，再稀釋成0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL，以質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制工作曲線。

2.2.2 回收率和精密度

稱蜂蜜4份，分別加入不同質(zhì)量濃度的氯霉素對照品溶液，使蜂蜜中氯霉素的質(zhì)量濃度為0.1，8.0，40 μg/kg，平行測定3次，計算回收率。再稱取蜂蜜6份，按相同方法制備供試品溶液，重復(fù)進樣，計算RSD值。

2.2.3 檢出限和定量限

取標液不斷稀釋，當信噪比為3時作為方法的檢出限，信噪比為10時為方法的定量限[4]。

2.3 高效液相色譜法與快速檢測法的比較

稱取7份含有氯霉素蜂蜜用空白蜂蜜稀釋成不同質(zhì)量濃度，記為樣①～⑦號，同時做快速檢測和液相檢測；再將對照液稀釋成0.100，0.05，0.04，0.03，0.02，0.01 ng/mL進行快檢，將對照品的顯色結(jié)果作為樣品的參照，推出蜂蜜中氯霉素的實際質(zhì)量濃度，得到快速檢測法的檢出限，與液相色譜法的檢出限進行對比。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法選擇

3.1.1 不同凈化方法的對比

不同方法制備的供試品溶液的液相譜圖比較見圖1。

圖1 不同方法制備的供試品溶液的液相譜圖比較

圖3 不同氯霉素濃度蜂蜜試液的色譜圖

從圖1可以看出，化學(xué)法除雜效果較差，雖氯霉素檢出含量高，但可能是在保留時間處有其他雜質(zhì)與目標物重疊。

3.1.2 流動相和柱溫的選擇

不同流動相洗脫的液相結(jié)果見表1。

表1 不同流動相洗脫的液相結(jié)果

流動相c氯霉素出峰最晚，流動相b出峰最快；理論塔板數(shù)c＞b＞a＞4 000，符合藥典要求，且氯霉素都能完全分離，峰形也較好。流動相a含有緩沖鹽，配制和沖洗過程較繁瑣；流動相c的洗脫能力比b弱，在沖洗時會消耗較多試劑，因此，流動相b最合適。

不同柱溫下液相結(jié)果見表2。

表2 不同柱溫下液相結(jié)果

當流動相和色譜柱之間的溫差增大時，由于溫度不平衡會導(dǎo)致的峰變形加劇[5]，從表2可以看出，柱溫20～60℃時，隨柱溫升高，保留時間變短，同時分離度、峰寬也發(fā)生變化，升高柱溫會使塔板數(shù)降低，峰形變差。綜合考慮，選40℃作為檢測柱溫。

3.1.3 陰性對照

流動相的液相色譜見圖2，不同氯霉素質(zhì)量濃度蜂蜜試液的色譜見圖3。

圖2 流動相的液相色譜圖

從圖2～圖3可以看出，標液中2.537 min的峰是溶劑峰，6.410 min的為氯霉素峰，2.011 min的峰為雜峰。

3.2 方法驗證

3.2.1 線性關(guān)系考查

氯霉素對照品標準曲線見圖4。

圖4 氯霉素對照品標準曲線

從圖4的公式和相關(guān)系數(shù)看出，對照品溶液在0.10～10.00 μg/mL的范圍內(nèi)線性良好。

3.2.2 回收率和精密度

加標回收率平均為81.68%，RSD值為10.81%，該方法準確度和精密度較好。

3.2.3 檢出限和定量限

氯霉素標液稀釋至S/N=3.56時所對應(yīng)的質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL，在蜂蜜中的檢出限為0.625 μg/kg。S/N=10.81時所對應(yīng)的質(zhì)量濃度為10 ng/mL，則方法的定量限為 8 μg/kg。

3.3 液相色譜法與快速檢測法的比較

不同質(zhì)量濃度氯霉素的樣品快檢結(jié)果對比見表3，不同質(zhì)量濃度對照品溶液快檢結(jié)果見表4。

表3 不同質(zhì)量濃度氯霉素的樣品快檢結(jié)果對比

+++++++++++++++++++++++++++注：“+”表示顏色的深度，“+”越多則顏色越深檢測項目空白樣⑦樣⑥樣⑤樣④樣③樣②樣①C T++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

表4 不同質(zhì)量濃度對照品溶液快檢結(jié)果

根據(jù)說明書，測試線T比對照線C深或相同，則氯霉素質(zhì)量濃度低于檢出限或不含氯霉素。若T比C淺表示氯霉素質(zhì)量濃度高于檢出限，越淺則質(zhì)量濃度越高。因此看表3和4中樣①和標0.01 ng/mL快檢陽性，經(jīng)換算此時蜂蜜中氯霉素含量0.125 μg/kg。隨著樣品與標中氯霉素質(zhì)量濃度降低，T漸深，到樣⑤和標0.04 ng/mL T仍比C淺，說明氯霉素仍能檢出，到樣⑥和標0.05 ng/mL時，T與C完全一致，氯霉素已檢不出。因此樣⑤和標0.04 ng/mL是氯霉素檢出限，經(jīng)換算得快檢法氯霉素檢出限為 0.062 5 μg/kg。在 0.125～0.062 5 μg/kg 時，快檢顏色變化成一定梯度，可做作為半定量的依據(jù)。

蜂蜜樣與氯霉素對照品的色譜見圖6。

圖6 蜂蜜樣與氯霉素對照品的色譜

將快檢陽性的樣①、②的液相譜圖與標0.5 ng/mL（儀器檢出限）的液相譜圖進行對比，樣品在標的保留時間6.405 min處沒有出峰，可見快檢法靈敏度更高。但在6.7 min有一疑似峰，與目標峰部分重疊，需要用質(zhì)譜進一步確認。

4 結(jié)論

用固相萃取柱凈化，40℃柱溫，30%乙腈作為流動相，該方法回收率81.68%，精密度10.81%，檢出限為0.625 μg/kg，相比快速檢測條差10倍，雖無法達到國標方法的最低檢出限0.1 μg/kg，但是在檢出限質(zhì)量濃度時氯霉素保留時間附近有一疑似峰，不能排除此方法能檢出更低質(zhì)量濃度的可能性。

[1]姚駿，李沛然，暴悅梅，等.動物源性食品中氯霉素殘留檢測研究進展 [J].食品研究與開發(fā)，2014（4）：118-120.

[2]吳華，黃鴻，歐劍峰，等.高效液相色譜法測定蜂蜜中氯霉素殘留量的研究 [J].四川化工，2009，12（3）：40-42.

[3]盧坤，童群義.高效液相色譜法同時檢測蜂蜜中的5類抗生素殘留 [J].分析測試學(xué)報，2011，30（11）：1 320-1 323，1 328.

[4]胡曉慧，殷蓓蓓，寧準梅，等.一種快速痕量檢測蜂蜜中氯霉素殘留方法的研究 [J].食品工業(yè)，2013，34（6）：206-210.

[5]楊婕，張日清，金曉玲，等.高效液相色譜法在木本植物內(nèi)源激素含量檢測中的應(yīng)用 [J].經(jīng)濟林研究，2010，28 （1）：122-126.◇