彭彰文，徐天豪，譚新佳，羅思浩，陳 芳，吳竹青，2

（1.吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南吉首 416000；2.吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南吉首 416000）

山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）是無污染野生的山葡萄，不僅含有多種氨基酸，還含有VB1，VB2，VPP，VC，胡蘿卜素等多種微量元素。此外，山葡萄酒還富含黃酮類化合物，可預(yù)防動(dòng)脈硬化癥和癌癥[1-3]。野生的山葡萄，葡萄果粒小、皮厚、色素濃、酸度高、糖度低、單寧含量高，與野生的靈芝、人參一樣，營養(yǎng)成分非常豐富，故其市場價(jià)值極大[4-6]。

山葡萄酒品質(zhì)獨(dú)特，山葡萄酒的傳統(tǒng)文化源遠(yuǎn)流長、歷史悠久。武陵山區(qū)的居民，長期保持著用山葡萄做酒的習(xí)慣。每到秋天，山葡萄熟了，家家自釀山葡萄酒，春節(jié)期間用來招待客人，山葡萄酒果香撲鼻、醇和酸澀。國內(nèi)外當(dāng)前對于山葡萄酒研究不多，這主要是由于大眾對山葡萄酒認(rèn)知度和研究時(shí)間不足，對其研究深度和廣度不夠，且對其特征的香氣成分有待進(jìn)一步驗(yàn)證。李華等人[7]報(bào)道了葡萄酒香氣成分的氣相色譜分析，研究得出了葡萄酒香氣成分氣相色譜分析方法的最新研究進(jìn)展。陶永勝等人[8]采用“電子鼻”等非色譜方法分析葡萄酒香氣的特點(diǎn)，闡述了葡萄酒香氣成分氣相色譜分析的不同檢測器方法?，F(xiàn)階段，對于葡萄酒香氣成分的分析多采用以氣相色譜為代表的色譜技術(shù)，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS） 通過色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高鑒別特性，可一次性完成對復(fù)雜的混合樣品進(jìn)行分離、定性和定量分析，是一種較完美的現(xiàn)代分析方法[9-10]。

開展山葡萄酒釀造工藝及香氣成分變化研究旨在為山葡萄酒釀造提供參考，并通過對山葡萄酒釀造和貯藏過程中香氣成分變化進(jìn)行詳細(xì)分析，以準(zhǔn)確控制山葡萄酒的品質(zhì)。一方面，實(shí)現(xiàn)了對山葡萄酒品質(zhì)的深入分析，為葡萄酒的生產(chǎn)工藝提供有價(jià)值的參考資料；另一方面，武陵山區(qū)山葡萄酒的開發(fā)，符合當(dāng)今市場化趨勢，具有一定的市場開發(fā)價(jià)值，同時(shí)有利于推動(dòng)武陵山區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

山葡萄，購于吉首市農(nóng)貿(mào)市場，經(jīng)測定新鮮山葡萄糖度在18%左右；安琪活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司提供；葡萄糖、蔗糖、偏重亞硫酸鉀、殼聚糖等，均為市售食品級(jí)。

FA2004型電子天平、722型可見分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司產(chǎn)品；固相微萃取進(jìn)樣器及萃取纖維頭，美國Supelco公司產(chǎn)品。

1.2 工藝流程及操作要點(diǎn)

1.2.1 山葡萄酒精發(fā)酵工藝流程

新鮮山葡萄→清洗→除梗、破碎→加偏重亞硫酸鉀、果膠酶→加入活化酵母酒精發(fā)酵→壓榨、分離→后發(fā)酵→倒罐→蘋果酸-乳酸發(fā)酵→陳釀→澄清處理→過濾→殺菌→灌裝、封口→山葡萄酒→檢驗(yàn)→成品。

1.2.2 操作要點(diǎn)

（1） 原料選用及預(yù)處理。采用吉首市山葡萄，采摘時(shí)糖度積累要達(dá)到18%～22%（手持糖量計(jì)測定），含酸量在0.6～1.2 g/100 mL較合適，色素含量高，風(fēng)味濃郁、典型，無病蟲害，果膠酶添加量0.1%～0.2%，酶解溫度30～35℃，保持3 h后于73℃條件下進(jìn)行消毒30 s，然后加入固體偏重亞硫酸鉀120 mg/L，使得二氧化硫含量為 40～80 mg/L（GB/T 27586—2011），再根據(jù)所需酒精度進(jìn)行糖度和酸度的調(diào)整。

（2）干酵母活化。按試驗(yàn)用量稱取活性干酵母，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將安琪酵母加到無菌水（按1 g/mL溶解） 中，在38～43℃的水浴中保持30 min后活化完成，將活化好的酵母液冷卻至30℃以下備用。

（3）酒精發(fā)酵。將活化后的酵母添加到葡萄汁中。為了充分浸漬皮渣上的色素、單寧及芳香成分，要將皮渣壓入葡萄醪中，皮渣很厚并且往往浮在葡萄汁上，與空氣直接接觸，易感染有害雜菌，此時(shí)應(yīng)將發(fā)酵液從桶底放出，用泵將其噴淋在皮渣上，每天1～2次，亦可用壓板將皮渣壓在液面下30 cm左右，然后進(jìn)行壓榨分離。

（4）壓榨分離。山葡萄酒帶渣壓榨，當(dāng)主發(fā)酵完成后及時(shí)壓榨取出新酒，采用自流酒（不加壓流出）繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。

（5）陳釀。將山葡萄酒置于橡木桶中，并在通風(fēng)良好的環(huán)境中進(jìn)行陳釀，陳釀溫度12～15℃，環(huán)境相對濕度85%～90%，陳釀時(shí)間6個(gè)月以上。

1.3 山葡萄酒香氣成分的GC-MS分析

（1）山葡萄酒樣品處理。運(yùn)用頂空固相微萃取法[11-12]萃取山葡萄果酒香氣成分，取山葡萄酒樣5 mL于15 mL頂空瓶中，加入1.2 g NaCl，封口，于40℃條件下在磁力攪拌器上平衡20 min，插入老化后的萃取纖維頭吸附45 min，于進(jìn)樣口解析5 min后，采集數(shù)據(jù)。

（2） 色譜條件。色譜柱選擇 Agilent190191S-433型石英毛細(xì)管（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣（He） 流量1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；不分流進(jìn)樣，程序升溫：起始溫度35℃，保持5 min，以5℃/min升至110℃，保持2 min，以6℃/min升至150℃，保持2 min，以8℃/min升至220℃，保持10 min。

（3） 質(zhì)譜條件。四極桿溫度150℃，離子源溫度230℃，電子能量70 eV，離子化方式EI，分辨率1 000，質(zhì)量范圍30～500 U/s。

1.4 山葡萄酒釀造試驗(yàn)

1.4.1 山葡萄酒精發(fā)酵單因素試驗(yàn)

選取酵母菌接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵pH值為考查因素，以山葡萄酒酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，探究各因素對山葡萄酒精發(fā)酵的影響。

1.4.2 山葡萄酒酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酒精度作為評(píng)判指標(biāo)，把酵母菌接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵pH值作為考查因素，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，確定山葡萄酒精發(fā)酵的最佳工藝條件。

1.5 感官評(píng)價(jià)

評(píng)價(jià)指標(biāo)采用感官綜合評(píng)分，選擇師生共10人組成評(píng)價(jià)小組，對山葡萄酒樣品的色澤、口感、體態(tài)、風(fēng)味等進(jìn)行評(píng)價(jià)（100分計(jì)），取其平均值作為樣品的最終得分。

山葡萄酒感官品質(zhì)綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.6 數(shù)據(jù)分析

正交試驗(yàn)結(jié)果及驗(yàn)證性結(jié)果用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（X±S）。方差分析比較用t檢驗(yàn)，p<0.05時(shí)為顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 山葡萄酒精發(fā)酵單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵溫度對山葡萄酒精發(fā)酵效果的影響增強(qiáng)，酒精度呈上升趨勢，當(dāng)pH值超過3.4時(shí)，酵母菌活性降低，酒精度開始下降且在pH值為3.4時(shí)酒精度最大。因此，酵母發(fā)酵pH值應(yīng)以3.4左右為宜。

表1 山葡萄酒感官品質(zhì)綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.1.3 酵母菌接種量對山葡萄酒精發(fā)酵效果的影響

取100 mL葡萄糖汁置于250 mL錐形瓶中，發(fā)酵pH值3.2，發(fā)酵溫度28℃，分別加入果汁用量0.04%，0.06%，0.08%，0.10%，0.12%，0.14%，0.16%的活化酵母，恒溫發(fā)酵60 h。測量酒精度，研究酵母菌接種量對山葡萄酒精發(fā)酵的影響。

酵母菌接種量對山葡萄酒精發(fā)酵的影響見圖3。

取100 mL山葡萄汁置于250 mL錐形瓶中，固定酵母菌接種量0.10%，發(fā)酵pH值3.2，分別在溫度22，24，26，28，30，32，34℃下恒溫發(fā)酵60 h。測量酒精度，研究發(fā)酵溫度對山葡萄酒精發(fā)酵的影響。

發(fā)酵溫度對山葡萄酒精發(fā)酵的影響見圖1。

圖3 酵母菌接種量對山葡萄酒精發(fā)酵的影響

圖1 發(fā)酵溫度對山葡萄酒精發(fā)酵的影響

由圖1可知，當(dāng)發(fā)酵溫度超過22℃時(shí)，山葡萄酒精度隨發(fā)酵溫度增加而顯著增加，并在發(fā)酵溫度為30℃取得最大值；當(dāng)發(fā)酵溫度超過30℃后，山葡萄酒精度呈下降趨勢，故發(fā)酵溫度以30℃左右為宜。

2.1.2 發(fā)酵pH值對山葡萄酒精發(fā)酵效果的影響

取100 mL山葡萄汁置于250 mL錐形瓶中，固定酵母菌接種量0.10%，發(fā)酵溫度28℃，分別調(diào)節(jié)pH 值為 2.6，2.8，3.0，3.2，3.4，3.6，3.8，恒溫發(fā)酵60 h。測量酒精度，研究發(fā)酵溫度對山葡萄酒精發(fā)酵的影響。

發(fā)酵pH值對山葡萄酒精發(fā)酵的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵pH值對山葡萄酒精發(fā)酵的影響

由圖2可知，隨著發(fā)酵pH值增加，酵母菌活性

由圖3可知，酵母菌接種量0.04%～0.10%的范圍內(nèi)，山葡萄酒精度隨酵母菌接種量增加而呈上升趨勢，酵母菌接種量在0.10%時(shí)，山葡萄酒精度達(dá)到最大；當(dāng)酵母菌接種量超過0.10%后，山葡萄酒精度開始下降。因此，酵母菌接種量以0.10%左右為宜。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對山葡萄酒精發(fā)酵效果的影響

取100 mL山葡萄汁置于250 mL錐形瓶中，固定酵母菌接種量0.10%，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵pH值3.2，分別恒溫發(fā)酵 24，36，48，60，72，84，96 h，測量酒精度，研究發(fā)酵時(shí)間對山葡萄酒精發(fā)酵的影響。

發(fā)酵時(shí)間對山葡萄酒精發(fā)酵的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對山葡萄酒精發(fā)酵的影響

圖4 結(jié)果表明，在發(fā)酵時(shí)間為24～72 h時(shí)，發(fā)酵液中氧氣含量充足，酵母菌代謝旺盛，山葡萄酒精度隨發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，山葡萄酒精度達(dá)最高；發(fā)酵時(shí)間超過72 h后，山葡萄酒精度呈緩慢下降趨勢。因此，發(fā)酵時(shí)間應(yīng)在72 h左右為宜。

2.2 山葡萄酒精發(fā)酵正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以酒精度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以酵母菌接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵pH值為考查因素，選擇較優(yōu)因素，即發(fā)酵溫度28，30，32℃，發(fā)酵pH值3.0，3.2，3.4，酵母菌接種量0.10%，0.15%，0.20%，發(fā)酵時(shí)間48，60，72 h，通過L9（34）正交試驗(yàn)對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

正交因素與水平見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3，正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表4。

表2 正交因素與水平

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

由表2可以看出，D＞A＞C＞B，正交試驗(yàn)的各因素水平中發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、酵母菌接種量、發(fā)酵pH值對山葡萄酒精發(fā)酵的影響是依次減小的。由表3可知優(yōu)水平組合為A2B3C2D3，即酵母菌接種量0.15%，發(fā)酵pH值3.4，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間72 h。在此優(yōu)化工藝條件下，山葡萄發(fā)酵液酒精度實(shí)測值為8.4%（V/V），感官評(píng)分實(shí)測值為83分。

2.3 山葡萄酒香氣成分GC-MS分析結(jié)果

該試驗(yàn)主要是對山葡萄發(fā)酵酒及發(fā)酵酒貯藏3個(gè)月、貯藏7個(gè)月酒樣進(jìn)行了GC-MS分析。

新山葡萄酒樣香氣成分總離子流色譜圖見圖5，陳釀3個(gè)月山葡萄酒香氣成分總離子流色譜圖見圖6，陳釀6個(gè)月山葡萄酒香氣成分總離子流色譜圖見圖7，山葡萄酒香氣成分分析見表5。

圖5 新山葡萄酒樣香氣成分總離子流色譜圖

圖6 陳釀3個(gè)月山葡萄酒香氣成分總離子流色譜圖

圖7 陳釀6個(gè)月山葡萄酒香氣成分總離子流色譜圖

表5 山葡萄酒香氣成分分析

（續(xù)表5）

在貯藏過程中，其香氣成分中的醇類酯類物質(zhì)變化較大，隨著陳釀時(shí)間的進(jìn)行，3-甲基-1-丁醇由8.718%增加到24.478%，壬酸乙酯由2.389%增加到4.547%，其他物質(zhì)含量沒有大的波動(dòng)。因此，山葡萄酒在釀造過程中的主要香氣成分主要為壬酸乙酯、3-甲基-1-丁醇，同時(shí)乙酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙醇等酯類和醇類物質(zhì)也對酒液香氣有重要貢獻(xiàn)。

在葡萄酒生產(chǎn)中，醇類和酯類化合物是葡萄酒酵母發(fā)酵過程中的主要產(chǎn)物，對葡萄酒的香味具有重要影響，適量的高級(jí)醇可以給葡萄酒帶來良好香氣，酯類和酸類等化合物含量的不同使葡萄酒在風(fēng)味上產(chǎn)生很大的差別。在武陵山葡萄酒釀造和陳釀過程中，醇類與酯類物質(zhì)變化較大，這與發(fā)酵的工藝條件和陳釀的溫度、容器等有關(guān)，但是對香氣物質(zhì)在發(fā)酵和山葡萄酒陳釀過程中的相關(guān)生理和化學(xué)變化的機(jī)理尚不明確。因此，對加強(qiáng)儀器功能及效率提出了新要求，對香氣物質(zhì)變化機(jī)理探討、掌握葡萄及發(fā)酵過程中香氣成分的形成機(jī)制問題，還有待進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

以武陵山地區(qū)山葡萄為原料，研究山葡萄酒釀造工藝和陳釀過程中香氣成分的變化。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化得到山葡萄酒發(fā)酵工藝最優(yōu)參數(shù)，即酵母菌接種量0.15%，發(fā)酵pH值3.4，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間72 h。在此優(yōu)化工藝條件下，山葡萄發(fā)酵液酒精度實(shí)測值為8.4%（V/V），所得山葡萄酒色澤呈深紅色，酸味協(xié)調(diào)且具山葡萄獨(dú)特風(fēng)味，清香爽口，略帶澀味，感官評(píng)分實(shí)測值為83分。

山葡萄酒陳釀過程中香氣成分變化，對山葡萄酒的風(fēng)味口感有著很重要的影響，通過頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分析了新釀制山葡萄酒、山葡萄酒陳釀3個(gè)月和6個(gè)月香氣成分的變化情況。結(jié)果表明，山葡萄酒在釀造過程中，醇類與酯類的變化較大，其中主要香氣成分為壬酸乙酯和3-甲基-1-丁醇，同時(shí)乙酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙醇等酯類和醇類物質(zhì)也是構(gòu)成山葡萄酒香氣成分的重要組成部分。

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