郭文韜 張燕

[摘要] 目的 探討片仔癀對裸鼠人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞移植瘤的抑制作用及其對ABCB1、ABCG2蛋白表達(dá)的影響。 方法 48只裸鼠皮下接種腫瘤干細(xì)胞建立人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞移植瘤模型。依照隨機數(shù)字表法將其分為對照組、阿霉素組、片仔癀組、片仔癀與阿霉素聯(lián)合組，每組各12只，分別予以相應(yīng)的干預(yù)，4周后處死裸鼠，測量瘤體體積及稱取其重量，計算腫瘤體積及重量抑制率；免疫組織組化學(xué)（SP法）及Western blot檢測瘤體內(nèi)ABCB1、ABCG2的表達(dá)。 結(jié)果 與對照組比較，阿霉素組、片仔癀組、聯(lián)合組瘤體體積及重量明顯降低（P < 0.05），與片仔癀組比較，聯(lián)合組生長受到明顯抑制（P < 0.01）；與對照組比較，片仔癀組、聯(lián)合組可明顯降低ABCB1、ABCG2的表達(dá)（P < 0.05），且聯(lián)合組較片仔癀組明顯下調(diào)（P < 0.05）。 結(jié)論 片仔癀可明顯抑制人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長，且能夠增強阿霉素的作用，其作用機制與抑制膜轉(zhuǎn)運蛋白ABCB1、ABCG2的表達(dá)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 片仔癀；骨肉瘤；干細(xì)胞移植瘤；影響

[中圖分類號] R738.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（a）-0004-05

[Abstract] Objective To explore the inhibitory effect of Pien Tze Huang on the growth of human osteosarcoma stem cells transplantation tumor of nude mice and its effect on ABCB1 and ABCG2 protein expression. Methods The model of human osteosarcoma tumor stem cell transplantation tumor was established by subcutaneous tumor stem cells in nude mice. According to the random number table method ， 48 nude mice were divided into control group， adriamycin group， Pien Tze Huang group， Pien Tze Huang and adriamycin combined group， with 12 mice in each group， The nude mice were executed after four weeks of intervention. The volume and weight of the tumor were measured and the tumor volume and weight inhibition rate were calculated. The expression of ABCB1 and ABCG2 in the tumor was detected by immunohistochemistry （SP） and Western blot. Results Compared with the control group， the volume and weight of tumor were significantly reduced in theadriamycin group， Pien Tze Huang group and combined group （P < 0.05）. Compared with Pien Tze Huang group， the combined group growth was significantly inhibited. （P < 0.01）. SP and Western blot results showed that the expressions of ABCB1 and ABCG2 in the Pien Tze Huang group and combined group were significantly down-regulated than that in the control group （P < 0.05）， and combined group was significantly lower than that in the Pien Tze Huang group （P < 0.05）. Conclusion Pien Tze Huang can significantly inhibit the growth of tumor stem cells in human osteosarcoma tumor stem cells， and it can enhance the effect of adriamycin. Which may be related to inhibit the expression of membrane transporter ABCB1 and ABCG2.

[Key words] Pien Tze Huang； Osteosarcoma； Stem cell transplantation tumor； Effect

骨肉瘤好發(fā)于青少年，惡性程度高，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，盡管隨著醫(yī)療技術(shù)的提高，目前患者5年生存率可達(dá)到70%，但仍有30%患者因?qū)熕幬锏哪退幎鴮?dǎo)致治療失敗[1]。前期大量的研究表明多種機制與骨肉瘤化療耐藥的產(chǎn)生有關(guān)[2-3]，包括ABC轉(zhuǎn)運蛋白的過表達(dá)，細(xì)胞凋亡調(diào)控異常，細(xì)胞內(nèi)解毒系統(tǒng)紊亂及腫瘤干細(xì)胞的存在等[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞能通過上調(diào)ABC轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)等作用，使其對化療藥物具有耐藥性，成為腫瘤耐藥的重要原因[6]。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)骨肉瘤干細(xì)胞中高表達(dá)ABCB1、ABCG2蛋白，片仔癀可明顯抑制耐藥骨肉瘤干細(xì)胞的增殖，抑制ABCB1、ABCG2蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)其耐藥[7]。本實驗通過觀察片仔癀對裸鼠人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞移植瘤及其ABCB1、ABCG2的表達(dá)影響，進(jìn)一步探討片仔癀對骨肉瘤耐藥性的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及裸鼠

人骨肉瘤MG63細(xì)胞由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院提供，MG63/ADM細(xì)胞株通過ADM大劑量間隙作用誘導(dǎo)而成[8]。BABL/C裸鼠由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，4～6周齡，體重（14±2）g，雌雄各半。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[許可證號SYXK（閩）2009-0001]，室溫控制在（25±1）℃，相對濕度為40%～60%的SPF層流柜中。

1.2 主要試劑

DMEM/F12（美國Gibco公司，批號：NZE1197）；Accutase酶（美國invitrogen公司，批號：A1110507）；B-27（美國Hyclone公司，批號：1626662）；內(nèi)皮生長因子（EGF）（美國PeproTech公司，批號：0216AFC05）；堿性成纖維生長因子（bFGF）（美國PeproTech公司，批號：0413AFC08）；ABCB1單克隆抗體、ABCG2單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗（美國CST公司，批號：0003、0006、25、29）；片仔癀膠囊（漳州片仔癀藥業(yè)有限公司，規(guī)格：300 mg/粒，批號：1101007）；阿霉素（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號：1103E3）。

1.3骨肉瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)

將對數(shù)期MG63/ADM細(xì)胞胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌離心去除殘留血清，以5×103個細(xì)胞每孔的密度傳到低黏附6孔板，無血清培養(yǎng)基（終濃度為EGF20 ng/mL、bFGF20 ng/mL、B-27 2%的DMEM/F12培養(yǎng)基）培養(yǎng)，待細(xì)胞球長至70 μm大小，為第1代細(xì)胞球，收集細(xì)胞懸液，800 r/min離心去除上清后加入accutase酶吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后，以5×103個細(xì)胞密度接種到低黏附6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)至3代。以獲得的第3代懸浮細(xì)胞球為實驗對象。

1.4 骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞裸鼠移植瘤模型建立及分組

取第3代懸浮細(xì)胞球，accutase酶消化，不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個/mL細(xì)胞懸液，按200 μL/只接種于裸鼠右腋前皮下。接種1周后，48只裸鼠依照隨機數(shù)字表分成4組，分別干預(yù)4周。對照組每日予0.2 mL生理鹽水灌胃，同時每隔2 d予以0.2 mL生理鹽水腹腔注射；片仔癀組每日予片仔癀溶液（濃度30 mg/mL）灌胃，給藥劑量按照小鼠給藥劑量與人的體表面積關(guān)系計算；阿霉素組予以阿霉素1 mg/kg腹腔注射2 d/次；聯(lián)合組中片仔癀給藥同片仔癀組，阿霉素給藥同阿霉素組。

1.5 標(biāo)本采集及計算腫瘤抑制率

末次給藥24 h后頸椎脫臼處死裸鼠，剝離裸鼠皮下瘤體，測量瘤體體積及稱重，計算腫瘤體積、重量抑制率。腫瘤體積抑制率（V）=（V對照組-V實驗組）/V對照組×100%，腫瘤重量抑制率[腫瘤重量抑制率（W）=（W對照組-W實驗組）/W對照組×100%]。

將瘤體分為兩部分：一部份瘤體4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，用于免疫組化檢測。另一部份-80℃保存，用于Western blot檢測。

1.6 免疫組化檢測移植瘤內(nèi)ABCB1、ABCG2的表達(dá)情況

瘤體置于4%多聚甲醛固定24 h后，經(jīng)逐級脫水石蠟包埋，切片脫臘水化后抗原修復(fù)，封閉，滴加一抗ABCB1（1∶800）、ABCG2（1∶1000）4℃過夜后滴加二抗室溫孵育2 h，DAB染色后觀察比較陽性目標(biāo)積分光密度。

1.7 Westen blot檢測瘤體內(nèi)ABCB1、ABCG2的表達(dá)

將各組瘤體RIPA裂解液充分研磨，置于冰上裂解15 min，提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液，混勻、變性后置于-20℃保存。每孔30 μg總蛋白上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠（分離膠濃度10%、濃縮膠濃度5%）電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF上，室溫封閉2 h，置于稀釋的一抗ABCB1（1∶1000）、ABCG2（1∶1000），4℃冰箱搖床上孵育過夜，HRP標(biāo)記的二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，加入適量的ECL顯影劑，以β-actin為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)掃描并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用One-Way ANOVA 方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗，方差不齊采用Duunett′s T3法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 片仔癀對骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞裸鼠移植瘤體積及重量的影響

與對照組比較，各用藥組瘤體體積及重量均有減少（P < 0.05）；與阿霉素組比較，片仔癀組腫瘤體積抑制率及重量抑制率高（P < 0.01）；與片仔癀組比較，聯(lián)合組瘤體體積抑制率及重量抑制率明顯增高（P < 0.01），提示裸鼠移植瘤生長受到了明顯抑制。見表1、2。

2.2 免疫組化檢測片仔癀對骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞裸鼠移植瘤ABCB1、ABCG2表達(dá)的影響

免疫組化中ABCB1、ABCG2在細(xì)胞膜上成棕黃色陽性表達(dá)，檢測如圖1、2所示，對照組、阿霉素組、片仔癀組、聯(lián)合組中陽性目標(biāo)積分光密度表達(dá)呈逐漸降低趨勢。陽性目標(biāo)積分光密度阿霉素組與對照組比較未見明顯差異；片仔癀組、聯(lián)合組與對照組比較，陽性目標(biāo)積分光密度明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），聯(lián)合組陽性目標(biāo)積分光密度最低，與片仔癀組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

2.3 Western blot檢測片仔癀對裸鼠移植瘤ABCB1、ABCG2表達(dá)的影響

各組內(nèi)參蛋白β-actin的表達(dá)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。與對照組比較，阿霉素組ABCB1、ABCG2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；片仔癀組和聯(lián)合組的ABCB1、ABCG2蛋白表達(dá)降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖3。

3 討論

骨肉瘤對化療藥物的耐藥是目前臨床治療的一個瓶頸問題，其產(chǎn)生機制與多種因素有關(guān)，近期發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞與骨肉瘤耐藥的發(fā)生有重要關(guān)系[9]。骨肉瘤干細(xì)胞擁有強大的自我更新能力和多向分化能力，2005年Gibbs等[10]首先在采用無血清條件下從骨肉瘤細(xì)胞中分離出表達(dá)多功能胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的骨肉瘤干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些多處于靜止期或休眠期，使得其對作用于細(xì)胞周期的化療藥物不敏感。骨肉瘤干細(xì)胞具有增強DNA修復(fù)能力，上調(diào)ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)等作用，在化療過程中能逃避化療藥物的毒性作用，一旦化療藥物作用消失，該類細(xì)胞可以通過自我更新、無限增殖使腫瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[11]。有學(xué)者認(rèn)為腫瘤是一種干細(xì)胞疾病，腫瘤的耐藥性產(chǎn)生于腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性密切相關(guān)，只有消除腫瘤干細(xì)胞才有可能解決腫瘤治療的耐藥問題，提高療效[12]。

在中醫(yī)學(xué)中骨肉瘤屬“石癰”“石疽”“石巖”等范疇。《醫(yī)宗金鑒·外科心法》：“膝痛，欣腫色紅痛，疵疽如痛而不紅，紅軟為順，堅硬為逆”和“下石疽在膝上生”描述了骨肉瘤的癥狀及發(fā)生部位。根據(jù)其病因病機，歷代醫(yī)家從不同的側(cè)面對本病的認(rèn)識和治法作了探索和補充，多認(rèn)為與“毒邪”關(guān)系密切，常予化瘀散結(jié)清熱解毒之法[13]。片仔癀是傳統(tǒng)名貴中成藥由三七、麝香、牛黃、蛇膽等天然藥材組成。具有清熱解毒、消腫散結(jié)、活血化瘀的顯著功效。片仔癀可通過抑制PI3K/Akt信號途徑的激活，誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡；通過抑制P-gp蛋白的表達(dá)增加骨肉瘤阿霉素耐藥細(xì)胞對化療藥物的敏感性，逆轉(zhuǎn)骨肉瘤耐藥的作用[14-15]。

我們前期通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，通過無血清培養(yǎng)的骨肉瘤干細(xì)胞高表達(dá)ABCB1、ABCG2，使用片仔癀可抑制骨肉瘤干細(xì)胞的生長，下調(diào)ABCB1、ABCG2蛋白表達(dá)[7]。本研究在此基礎(chǔ)上，建立骨肉瘤干細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，觀察片仔癀對骨肉瘤干細(xì)胞移植瘤的影響。研究結(jié)果表明，片仔癀、片仔癀與阿霉素聯(lián)用可明顯抑制裸鼠移植瘤的生長，表現(xiàn)為瘤體體積及重量抑制率較對照組明顯增高，并且片仔癀與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對腫瘤生長抑制最為明顯，說明片仔癀對骨肉瘤干細(xì)胞裸鼠移植瘤具有抑制作用，同時在體內(nèi)對阿霉素具有化療增敏作用。

ABCB1、ABCG2屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白的超家族成員，其可依賴 “藥泵”作用，一邊結(jié)合ATP，一邊結(jié)合藥物，通過ATP供能，將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度降低，減少化療藥物對腫瘤細(xì)胞的毒性，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞對不同化療藥物的耐藥[16]。Gomes等[17]發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性與ABCBl、ABCG2表達(dá)水平密切相關(guān)，ABCBl、ABCG2水平越高，則藥物敏感性越低。Di Fiore等[18]骨肉瘤細(xì)胞中分離出能夠大量分泌ABCG2蛋白的腫瘤干細(xì)胞系3AB-OS，其能夠使骨肉瘤細(xì)胞將化療藥物排出，并能激活大量抗細(xì)胞凋亡基因，從而有助于耐藥性的產(chǎn)生。本實驗中發(fā)現(xiàn)阿霉素組與對照組的ABCB1、ABCG2蛋白表達(dá)無明顯差異，而片仔癀組、片仔癀與阿霉素聯(lián)用可明顯下調(diào)ABCB1、ABCG2蛋白的表達(dá)，說明片仔癀可以通過抑制ABC轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)，增加骨肉瘤干細(xì)胞裸鼠移植瘤對阿霉素敏感性，達(dá)到抑制移植瘤生長，起到逆轉(zhuǎn)耐藥作用。

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