李二粉, 張媚玉, 馬合勤, 張嘉慧, 劉 戎, 曾振靈, 賀利民*

(1. 國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)), 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 廣東 廣州 510642; 2. 佛山市順德區(qū)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心, 廣東 佛山 528333)

喹乙醇屬于人工合成的喹惡啉類藥物,是20世紀(jì)70年代初由德國(guó)拜爾公司研究合成的抗菌促生長(zhǎng)劑,抗菌譜廣。喹乙醇具有蛋白同化作用,能提高飼料轉(zhuǎn)化率[1]。但鑒于該藥物的安全性問(wèn)題,歐盟和美國(guó)等相關(guān)國(guó)家已禁止喹乙醇在食品動(dòng)物生產(chǎn)中使用[2],我國(guó)規(guī)定喹乙醇禁用于家禽和水產(chǎn)動(dòng)物[3], 2019年5月1日起禁用于食品動(dòng)物[4]。然而,受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使,喹乙醇在養(yǎng)殖業(yè)中存在非法使用現(xiàn)象。近期,在山東等地的飼料生產(chǎn)企業(yè)、養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)現(xiàn)非法添加、濫用喹乙醇藥物現(xiàn)象,對(duì)動(dòng)物性食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。公眾對(duì)食品安全關(guān)注度的提升以及國(guó)際貿(mào)易對(duì)食品安全管理的嚴(yán)格性,給喹乙醇的殘留分析技術(shù)提出了更高的要求。

喹乙醇在動(dòng)物體內(nèi)代謝很快,3-甲基喹惡啉-2-羧酸(MQCA)是其主要代謝物,國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)認(rèn)定MQCA為喹乙醇的殘留標(biāo)示物[5]。MQCA在動(dòng)物組織中主要以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在[6],通常的提取液不能將其從動(dòng)物組織中提取出來(lái),直接采用有機(jī)溶劑和酸化提取液提出、再經(jīng)液-液反萃取或固相萃取凈化的文獻(xiàn)有許多[7-12],但這些方法只能夠提取游離形式的少量MQCA。采用酶解[13-16]、酸解[17-19]和堿解[20,21]的水解方式較多,原理都是破壞MQCA與組織的共價(jià)結(jié)合,使其游離出來(lái),再提取、凈化。但上述基于3種水解方式的文獻(xiàn)報(bào)道均是采用傳統(tǒng)的空白試樣添加評(píng)價(jià)回收率的方式來(lái)構(gòu)建分析方法,無(wú)法反映水解方式對(duì)喹乙醇給藥制備的陽(yáng)性雞肉樣品的實(shí)際解離效率,導(dǎo)致基于不同水解方法測(cè)定MQCA殘留的結(jié)果產(chǎn)生大的偏差。更令人遺憾的是,這些文獻(xiàn)中報(bào)道的采用3種方式水解試樣后,絕大多數(shù)采用鹽酸將水解液pH調(diào)至強(qiáng)酸性條件,然后采用MAX混合型陰離子交換固相萃取小柱凈化。此時(shí),MQCA的羧基(-COOH)不能夠離解,不是以負(fù)離子形式存在;相反,MQCA在強(qiáng)酸條件下應(yīng)該主要為喹惡啉正離子形式,因而其無(wú)法與MAX上的季銨正離子發(fā)生離子相互作用,結(jié)果MQCA的回收率都非常低。

為此,本研究采用給雞灌服喹乙醇,以制備的陽(yáng)性雞肉試樣為對(duì)象,系統(tǒng)分析比較了基于酶解、酸解和堿解3種方式水解測(cè)定MQCA殘留量的結(jié)果。采用優(yōu)化后的最佳堿水解方法水解雞肉試樣,水解液直接采用MAX混合型陰離子交換固相萃取小柱凈化、富集,建立了簡(jiǎn)便、靈敏、科學(xué)和可靠的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定雞肉組織中MQCA殘留的分析方法,在動(dòng)物性食品中MQCA殘留的日常監(jiān)督檢測(cè)中獲得廣泛的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-30A超高效液相色譜分析系統(tǒng)(日本島津公司); API 5500三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)ABI公司); Thermo D-37520型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司); SHA-B型恒溫水浴振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司); Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司); CNW Poly-Sery MAX混合型陰離子交換固相萃取小柱(3 mL/60 mg, 60 μm,上海安譜公司)。

氫氧化鈉(上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司);甲醇和乙腈(色譜純,美國(guó)Fisher公司);甲酸(色譜純,德國(guó)Sigma-Aldrich公司);正己烷(分析純,廣州化學(xué)試劑廠); MQCA標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥ 99%,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所); MQCA-d4(純度≥ 99%,加拿大Toronto Research Chemicals公司)。

健康雞購(gòu)于廣東智威農(nóng)業(yè)科技股份有限公司。

1.2 陽(yáng)性雞肉樣品的制備

將從市場(chǎng)購(gòu)得的6只健康雞((1.5±0.1) kg)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,在確定無(wú)MQCA殘留的情況下,隨機(jī)分為空白組和給藥組?？瞻捉M3只正常飼養(yǎng),給藥組3只以40 mg/kg b. w.的劑量,每天給藥1次,連續(xù)給藥3天,分別于末次給藥后12 、24和48 h宰殺,給藥組3只雞分別命名為1號(hào)雞、2號(hào)雞和3號(hào)雞,同時(shí)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)宰殺空白雞作為對(duì)照品,分取雞肉置-20 ℃冷藏,待檢測(cè)。

1.3 前處理方法

準(zhǔn)確稱取2 g(±0.01 g)搗碎的雞肉,置于50 mL聚丙烯離心管中,加入6 mL 1 mol/L NaOH溶液,渦旋1 min后置于50 ℃恒溫水浴鍋中,振蕩水解1 h。取出冷卻,于4 ℃ 9 000 r/min離心10 min,取上清液,加入6 mL正己烷除脂,9 000 r/min離心5 min,吸取下層溶液,定容至8 mL,取4 mL過(guò)MAX小柱(預(yù)先用3 mL甲醇和3 mL 0.2% (v/v)氨水活化),依次用3 mL水洗,3 mL 2%(v/v)甲酸甲醇洗脫,洗脫液用氮?dú)獯蹈伞Ｓ?0%(v/v)甲醇水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)溶解殘?jiān)?渦旋1 min,超聲10 min后,于4 ℃ 15 000 r/min離心10 min,上機(jī)檢測(cè)。

1.4 液相色譜和質(zhì)譜條件

液相色譜條件:反相色譜柱Phenomenex Luna C18(150 mm×2 mm, 5 μm),柱溫35 ℃,流速為0.25 mL/min,流動(dòng)相A為0.1%(v/v)甲酸乙腈,流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序:0.5 min, 5%A; 0.5～4.0 min, 5%A～70%A; 4.0～7.0 min, 70%A～90%A; 7.0～9.0 min, 90%A～5%A。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI),選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)正離子模式,電噴霧電壓(IS)為4 500 V,霧化氣壓力34 kPa,氣簾氣壓力(CUR)為40 kPa,離子源溫度(TEM)為600 ℃, MQCA及其內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

* MQCA: 3-methyl quinoline-2-carboxylic acid; quantitative ion.

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用甲醇配制20、 100和1000 μg/L的MQCA標(biāo)準(zhǔn)工作液和100 μg/L MQCA-d4 內(nèi)標(biāo)溶液。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液：空白雞肉試樣按1.3節(jié)處理,獲得空白基質(zhì)提取液,用于稀釋MQCA標(biāo)準(zhǔn)溶液,制備1、2、5、10、50、100 μg/L系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液(內(nèi)標(biāo)法均加入100 μg/L MQCA-d4內(nèi)標(biāo)溶液100 μL)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察

2.1.13種方法水解效率的比較

分別采用酶解[14]、酸解[19]和堿解(文獻(xiàn)[21]方法及本文方法) 4種方式水解1號(hào)雞,2號(hào)雞和3號(hào)雞雞肉樣品(每個(gè)樣品6個(gè)平行),采用內(nèi)標(biāo)法定量,LC-MS/MS測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。酶解和酸解方法僅檢測(cè)到1號(hào)和2號(hào)雞肉組織中低含量的MQCA殘留,而且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)較大,3號(hào)雞均未檢出MQCA;本工作建立的堿解法則在1、 2和3號(hào)雞中都檢出了MQCA殘留,含量分別為282.0、170.4和5.9 μg/kg, 1號(hào)雞和2號(hào)雞中測(cè)得的MQCA含量分別高出酶解法和酸解法近30和20倍。這表明,由于MQCA與組織大量共價(jià)結(jié)合,采用文獻(xiàn)的酶解和酸解方法可能沒(méi)有全部將MQCA從組織中解離出來(lái)。為了證明這點(diǎn),酶解和酸解溶液不進(jìn)一步采用固相萃取凈化,將酸解液和酶解液用流動(dòng)相稀釋后直接上機(jī)檢測(cè),表明兩種方法的確均不能夠?qū)QCA從組織中有效解離出來(lái)。與堿解法相比,1號(hào)雞和2號(hào)雞的酸解效率小于15%,酶解法則小于40%。而且兩種方法都不適合在酸性條件下用MAX陰離子交換小柱凈化、富集正離子形式的MQCA。因此,水解不徹底和過(guò)柱條件不合理最終導(dǎo)致兩種方法的測(cè)定結(jié)果都非常低(1號(hào)雞和2號(hào)雞)或低濃度不能夠檢出(3號(hào)雞);而堿解法可將雞肉組織徹底分解為溶液,以共價(jià)結(jié)合存在的MQCA有效釋放出來(lái),堿性水解液直接過(guò)MAX小柱凈化,合乎陰離子交換作用原理,策略科學(xué)合理。

2.1.2氫氧化鈉水解條件的優(yōu)化

為了獲得最佳的水解效果,在溫和的50 ℃水解溫度條件下,對(duì)氫氧化鈉溶液濃度和水解時(shí)間進(jìn)行了進(jìn)一步考察優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)選擇了0.5、1.0、1.5和2.0 mol/L的NaOH溶液水解雞肉試樣(2號(hào)雞),結(jié)果表明,0.5 mol/L NaOH溶液水解不充分,組織不能夠完全分解,測(cè)得的MQCA殘留量?jī)H為49.6 μg/kg; 1.0 mol/L NaOH溶液分解組織完全,整個(gè)樣品變?yōu)榈S色溶液,MQCA測(cè)定值達(dá)159.3 μg/kg;繼續(xù)增加NaOH濃度,MQCA測(cè)定值沒(méi)有多大變化,且堿濃度過(guò)高(2.0 mol/L)時(shí)水解液過(guò)柱時(shí)流速變慢。因此,本實(shí)驗(yàn)最后選擇1.0 mol/L NaOH溶液進(jìn)行水解。

在優(yōu)化的NaOH溶液濃度下,對(duì)水解時(shí)間進(jìn)行了考察。實(shí)驗(yàn)表明,水解30 min,組織分解不徹底,結(jié)合態(tài)MQCA未完全解離,MQCA測(cè)定值為104.2 μg/kg(2號(hào)雞);延長(zhǎng)水解時(shí)間分別到45 min和60 min,組織均分解完全,無(wú)殘?jiān)Ｓ?MQCA測(cè)定值分別為160.5 μg/kg和162.3 μg/kg,結(jié)合態(tài)MQCA解離完全。因此最后選擇60 min為氫氧化鈉水解時(shí)間。

2.1.3凈化方法的確定

關(guān)于喹乙醇代謝物MQCA的測(cè)定,主要采用上述3種方式水解組織試樣。絕大多數(shù)文獻(xiàn)中[13-19],酶解法通常用鹽酸將水解液pH調(diào)至強(qiáng)酸性條件,然后和酸解法一樣過(guò)MAX固相萃取小柱。而強(qiáng)酸性條件下,MQCA是不能夠解離形成負(fù)離子,因而無(wú)法與MAX上的季銨正離子發(fā)生有效的離子相互作用,所以MQCA的回收率都非常低,本研究也驗(yàn)證了這種凈化模式無(wú)法獲得高的回收率。雖然Huang等[20,21]報(bào)道在高溫下采用氫氧化鈉溶液水解雞肉組織中MQCA,但組織水解后也沒(méi)有直接選擇MAX混合型陰離子交換型固相萃取小柱凈化,而是將水解液繼續(xù)用濃鹽酸調(diào)至強(qiáng)酸環(huán)境,再連續(xù)用乙酸乙酯、甲醇以及氯仿等有機(jī)溶劑進(jìn)行液-液分配,反復(fù)萃取、凈化和濃縮。操作麻煩、過(guò)程復(fù)雜,藥物損失嚴(yán)重(見(jiàn)表2),且消耗大量有機(jī)溶劑,既不經(jīng)濟(jì)又不環(huán)保。

本研究采用氫氧化鈉溶液充分水解雞肉組織,使MQCA完全釋放出來(lái),水解液中MQCA羧基處于電離狀態(tài),可以直接與MAX小柱相互作用,獲得有效保留,從而達(dá)到理想的富集、凈化效果?？瞻纂u肉基質(zhì)的典型色譜圖見(jiàn)圖1，可以看出前處理效果較好。

表 2 采用4種不同水解方法獲得的雞肉中MQCA結(jié)果比較(n=6)

ND: not detected.

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

參考Achille等[22]評(píng)價(jià)MQCA測(cè)定過(guò)程中基質(zhì)效應(yīng)的計(jì)算方法,本研究測(cè)定了雞肉組織中MQCA檢測(cè)過(guò)程中的基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在10 μg/L濃度水平,采用文獻(xiàn)[14]酶解法測(cè)定MQCA的基質(zhì)效應(yīng)為-20.5%,具有弱的離子抑制作用;酸解法[19]的基質(zhì)效應(yīng)為24.3%,具有一定的離子增強(qiáng)作用;本研究采用的堿解法將雞肉組織完全消化,經(jīng)正己烷除脂和稀釋,使用MAX有效去除了大量水解產(chǎn)生的氨基酸和脂肪酸小分子,凈化后基質(zhì)效應(yīng)為-18.2%,具有弱的離子抑制作用。因此,為了補(bǔ)償檢測(cè)過(guò)程中的基質(zhì)效應(yīng),實(shí)際樣品檢測(cè)中既可以采用基質(zhì)匹配外標(biāo)曲線校正法,也可以采用同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。

2.3 線性關(guān)系、檢出限、定量限和回收率結(jié)果

在上述前處理研究的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了基于氫氧化鈉水解法結(jié)合LC-MS/MS測(cè)定雞肉組織中MQCA殘留的分析方法,方法學(xué)指標(biāo)見(jiàn)表3和表4。

由表3數(shù)據(jù)可以看出，在1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi),MQCA的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.99。

取空白雞肉樣品,加入低濃度MQCA標(biāo)準(zhǔn)工作液,制得一系列低濃度加標(biāo)樣品,按照1.3節(jié)方法處理樣品,以3倍和10倍信噪比分別計(jì)算方法的檢出限和定量限,結(jié)果表明,MQCA的檢出限和定量限分別為0.4 μg/kg和1.0 μg/kg(見(jiàn)表3)。

準(zhǔn)確稱取2 g(±0.01 g)切碎樣品,分別加入MQCA及其內(nèi)標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,制得1.0、5.0、50.0 μg/kg 3個(gè)添加水平的加標(biāo)樣品,每個(gè)濃度點(diǎn)共做6個(gè)平行,按照1.3節(jié)方法處理樣品,共做3個(gè)批次,每個(gè)批次間隔一天至數(shù)天,計(jì)算分析物回收率和RSD(見(jiàn)表4)。結(jié)果表明:采用外標(biāo)法計(jì)算,MQCA的平均回收率為71.7%～82.4%;采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算,其回收率為96.3%～103.7%, 2種方法的RSD分別為0.9%～4.5%和2.2%～6.0%。MQCA典型選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖1。

圖 1 MQCA和MQCA-d4的典型選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)量色譜圖Fig. 1 Typical selected reactive monitoring ion chromatograms of MQCA and MQCA-d4 For MQCA: a.10 μg/L standard solution; b. blank chicken muscle extracts; c.10 μg/L matrix-matched standard solution. For MQCA-d4: a.10 μg/L internal standard solution; b. blank chicken muscle extracts; c.10 μg/L matrix-matched internal standard solution.

QuantitativemethodLinearrange/(μg/L)LinearequationCorrelationcoefficient(r2)LOD/(μg/kg)LOQ/(μg/kg)Externalstandard1.0-100.0y1=3.72×103x+1.37×1030.99860.41.0Internalstandard1.0-100.0y2=0.53x+6.87×10-30.99950.41.0

y1: peak area of MQCA;y2: peak area ratio of MQCA to MQCA-d4;x: mass concentration of MQCA, μg/L.

表 4 MQCA的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

3 結(jié)論

本工作基于氫氧化鈉溶液水解,混合型強(qiáng)陰離子固相萃取小柱直接凈化,基質(zhì)匹配外標(biāo)曲線校正法和同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量,建立了簡(jiǎn)便、靈敏和可靠的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定雞肉組織中3-甲基喹惡啉-2-羧酸殘留分析方法。方法前處理方便、有效、經(jīng)濟(jì)環(huán)保,建立的方法可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物性食品中3-甲基喹惡啉-2-羧酸殘留的日常監(jiān)測(cè)。

:

[1] Chen Z L. Veterinary Pharmacology. 2nd ed. Beijing: China Agricultural Press, 2009: 278

陳杖榴. 獸醫(yī)藥理學(xué). 二版. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2009: 278

[2] Chen Q, Tang S S, Jin X, et al. Food Chem Toxicol, 2009, 47(2): 328

[3] Ministry of Agriculture. No 168 Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China.(2015-11-26)http://www.ixumu.com/download-36101.html

農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第168號(hào). (2015-11-26)http://www.ixumu.com/download-36101.html

[4] Ministry of Agriculture. No 2638 Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China. (2018-01-12)http://www.moa.gov.cn/govpublic/SYJ/201801/t20180112_6134888.htm

農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2638號(hào). (2018-01-12)http://www.moa.gov.cn/govpublic/SYJ/201801/t20180112_6134888.htm

[5] Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. Evaluation of Certain Veterinary Drug Residues in Food, WHO Technical Report Series, 1995, 851: 19

[6] Sestakova I, Kopanica M. Talanta, 1988, 35(10): 816

[7] Wu Y J, Yu H, Wang Y L, et al. J Chromatogr A, 2007, 1146(1): 1

[8] Lü H L, Wu C M, Cheng L L, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2012, 30(1): 45

呂海鸞, 吳聰明, 程林麗, 等. 色譜, 2012, 30(1): 45

[9] Zheng L, Wu Y J, Li Y, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2012, 30(7): 660

鄭玲, 吳玉杰, 李湧, 等. 色譜, 2012, 30(7): 660

[10] Guo X, Sun Z Z, Qi J Y, et al. Journal of China Agricultural University, 2014, 19(1): 156

郭霞, 孫振中, 戚雋淵, 等. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 19(1): 156

[11] Li Y S, Liu K L, Beier R C, et al. Food Chem, 2014, 160(10): 171

[12] Yi X B, Qiu L Q, Liu S Q, et al. Journal of Instrumental Analysis, 2015, 34(3): 346

易錫斌, 裘立群, 劉世琦, 等. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2015, 34(3): 346

[13] SN/T 0197-2014

[14] GB/T 20746-2006

[15] Zhao D H, Li Z G, Yang J L, et al. Chinese Journal of Analytical Laboratory, 2010, 29(9): 19

趙東豪, 黎智廣, 楊金蘭, 等. 分析試驗(yàn)室, 2010, 29(9): 19

[16] Liu Z C, Yang F, Yu K J, et al. Food Science, 2012, 33(12): 210

劉正才, 楊方, 余孔捷, 等. 食品科學(xué), 2012, 33(12): 210

[17] Bei Y J, Wang Y, He F, et al. Food Science, 2013, 34(10): 255

貝亦江, 王揚(yáng), 何豐, 等. 食品科學(xué), 2013, 34(10): 255

[18] Boison J O, Lee S C, Gedir R G. Anal Chim Acta, 2009, 637(1/2): 128

[19] Zhang X J, Zheng B, Zhang H, et al. J Sep Sci, 2011, 34(4): 469

[20] Huang L L, Xiao A G, Fan S X, et al. J AOAC Int, 2005, 88(2): 472

[21] Huang L L, Wang Y L, Tao Y F, et al. J Chromatogr B, 2008, 874(1/2): 7

[22] Achille C, Giorgio F, Pierangela P, et al. Anal Chem, 2008, 80: 9343