付 慧, 胡小鍵, 陳 曦, 林少彬

(中國疾病預防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所, 北京 100021)

多環(huán)芳烴(PAHs)作為一類廣泛存在的環(huán)境致癌性化合物,受到國內(nèi)外研究者的普遍關(guān)注。人類主要通過攝入含有PAH的食物或者吸入帶有PAH的空氣而受到污染[1-4]。進入體內(nèi)的PAH在肝臟內(nèi)分兩步轉(zhuǎn)化為結(jié)合態(tài)羥基多環(huán)芳烴(OH-PAH),而后經(jīng)尿液或糞便排出體外。由于PAH在體內(nèi)代謝期較短,因而測定尿中OH-PAH可反映近期PAH暴露情況[5]。以往的研究結(jié)果表明,應該選擇多個PAH代謝物(尤其是致癌性多環(huán)芳烴如苯并[a]蒽、苯并[a]芘等)作為生物標志物,來聯(lián)合評價人體的PAHs暴露。由于高環(huán)數(shù)多環(huán)芳烴主要經(jīng)糞便排泄,在尿中的濃度很低[6,7],需要有更靈敏的方法對尿中多種OH-PAHs代謝物進行同時測定,以期發(fā)現(xiàn)適于聯(lián)合評價PAHs內(nèi)暴露水平的OH-PAHs。

目前,測定尿中多環(huán)芳烴代謝物的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5,9-13]、液相色譜法[14-18]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19-26]。美國疾病控制與預防中心(CDC)采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)法測定尿中24種OH-PAH,尿液樣品經(jīng)液液萃取后再濃縮100倍,衍生化后進行儀器分析[5]。該方法作為標準操作方法用于美國生物監(jiān)測項目中尿液的測定,方法具有較高的靈敏度(檢出限達0.01 μg/L),但是前處理繁瑣,使用有機溶劑較多,大批量樣品測定時效率低下。高效液相色譜-熒光檢測法[14,16,17]具有選擇性強、分析時間短、檢出限低和重現(xiàn)性好等優(yōu)點,但對熒光強度較弱的化合物則無法測定。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法省略了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法繁瑣的前處理過程,且多反應監(jiān)測模式(MRM)的應用避免了分析過程中基質(zhì)的雜質(zhì)干擾,使檢出限明顯降低。目前,國內(nèi)對于多環(huán)芳烴的職業(yè)暴露研究多于非職業(yè)暴露,且可以測定的生物標志物少,這與分析手段不夠先進,檢出限高有關(guān)。全面了解不同地區(qū)PAHs的人體內(nèi)暴露水平,將為政府職能部門提供可靠的基礎數(shù)據(jù),為PAHs污染防控提供建議。因此發(fā)展快速靈敏、實用的分析檢測方法仍是分析化學工作者努力的方向。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

API4000三重四極桿質(zhì)譜儀(ESI源,美國Applied Biosystems公司), Acquity UPLC I-Class系統(tǒng)(美國Waters公司),純水機(美國Barnstead公司), Mettler AE 163十萬分之一電子天平(瑞士Mettler公司), C18固相萃取柱(3 mL/500 mg)(美國Supelco公司), 0.2 μm GHP針頭過濾器(美國Waters公司)。

甲醇(HPLC級,美國Fisher公司),無水醋酸銨、冰醋酸(分析純,國藥集團),β-葡萄糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶(美國Sigma-Aldrich公司),人工尿樣(湖州英創(chuàng)生物科技公司)。

人體尿液實際樣品采自淮河流域的100名志愿者。

1.2 標準溶液配制

OH-PAHs標準溶液:準確稱取一定量的目標化合物的標準品,以甲醇為溶劑配成質(zhì)量濃度約為1.00 g/L的單標儲備液;12種單標儲備液各取一定體積混合后,用甲醇定容,配制成各組分質(zhì)量濃度均為100 mg/L的混合標準中間液。用甲醇逐級稀釋得到使用液。

飽和醋酸-醋酸銨緩沖溶液:準確稱取740.0 g無水醋酸銨,加入500 mL水,用超聲波振蕩器振蕩溶解,用冰醋酸調(diào)pH至5.0。水解酶溶液:按照每個樣品使用3 000 Uβ-葡萄糖苷酸酶、70 U芳基硫酸酯酶的量,根據(jù)所購β-葡萄糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶的含量,計算實驗所需水解酶的量,準確稱取(3 000×(n+3)/A) gβ-葡萄糖苷酸酶和(70×(n+3)/B) g芳基硫酸酯酶(n為樣品數(shù),通常多加3份樣品的量;A、B分別為兩種酶的比活力,U/g),用飽和醋酸-醋酸銨緩沖溶液控溫超聲溶解并定容至10×(n+3) mL,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品前處理

將冰凍尿樣放置至室溫,準確移取10.0 mL尿樣于25.0 mL玻璃試管中,分別加入100 μL 200 μg/L的內(nèi)標溶液和10.0 mL的水解酶溶液,充分混勻后置于37 ℃恒溫箱中避光水解16 h,得水解液。依次用5.0 mL甲醇、5.0 mL水活化C18固相萃取柱,將水解液通過C18固相萃取柱富集,用1.0 mL水淋洗小柱,氮氣吹干40 min,然后用1.0 mL甲醇以0.25 mL/min進行洗脫,收集洗脫液,用甲醇定容至1.0 mL,混勻,0.2 μm GHP針頭過濾器過濾后,待測。

1.3.2色譜條件

Acquity UPLC?HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:25 ℃;進樣量3.00 μL;流速0.25 mL/min;流動相:甲醇(A)和水(B);梯度洗脫程序:0～22 min, 55%A～85%A; 22～25 min, 85%A～55%A。

1.3.3質(zhì)譜條件

ESI離子源,負離子多反應監(jiān)測(MRM);霧化氣:高純氮氣;碰撞氣(CAD): 83 kPa;氣簾氣(CUR): 138 kPa;霧化氣(GS1): 172 kPa;輔助氣(GS2): 241 kPa;噴霧電壓(IS): -4 000 V;離子源溫度(TEM): 450 ℃;掃描時間:100 ms;其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 12種OH-PAHs和2種同位素內(nèi)標的保留時間、監(jiān)測離子、碰撞電壓(CE)和去簇電壓(DP)

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

用甲醇將14種物質(zhì)的標準儲備液分別稀釋成100 μg/L的標準使用液,采用流動注射方式,以10 μL/min的流速進樣,在正離子和負離子模式下進行全掃描,以選擇適當?shù)碾婋x方式和分子離子峰。結(jié)果表明,在負離子模式下,目標化合物全掃描的分子離子[M-H]-最理想;以目標化合物的[M-H]-為母離子進行子離子掃描,選擇豐度最高、干擾較少的兩個子離子,優(yōu)化CE和DP;用100 μg/L混合標準溶液,在負離子模式下,以MRM方式優(yōu)化CUR、CAD、GS1、GS2、IS、TEM等參數(shù),結(jié)果見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

比較了14種物質(zhì)在Acquity UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和Acquity UPLC?HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)上的保留行為。結(jié)果顯示,在C18色譜柱上3-OHP和2-OHP不能完全分離,3-OHC和3-OHBAA無法完全分離;在T3色譜柱上,只有2-OHF和3-OHF無法完全分離,其他化合物均得到較好分離,目標化合物的響應值較高,各物質(zhì)峰形尖銳、對稱,峰形較好。另外,比較了甲醇-水、乙腈-水、0.05%(v/v)氨水乙腈-水、0.1%(v/v)氨水乙腈-水和0.2%(v/v)氨水-乙腈流動相對14種物質(zhì)離子化程度的影響。結(jié)果表明,使用甲醇-水溶液體系時選擇離子的色譜峰形和靈敏度均優(yōu)于其他溶液體系。方法選用Acquity UPLC?HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),用甲醇-水流動相進行梯度洗脫,尿中目標化合物的MRM色譜圖見圖1。將14個目標化合物單標溶液在最佳儀器條件下分別進樣以確定各目標化合物的保留時間,見表1。

圖 1 14種OH-PAHs的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatogram of the fourteen OH-PAHs Peak identifications: 1. 2-OHN; 2. 1-OHN; 3. 3-OHF & 2-OHF; 4. 2-OHP; 5. 3-OHP; 6. 1-OHP; 7. 1-OHPyr; 8. 3-OHC; 9. 3-OHBAA; 10. 6-OHC; 11. 1-OHBAA; 12. 3-OHP-13C6; 13. 6-OHC-13C6.

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1淋洗溶劑及用量的選擇

為了減小尿樣基體的干擾,提高實驗的靈敏度,實驗在水解液通過固相萃取柱富集后,加入了淋洗步驟?？疾炝瞬煌浔鹊募状?水、乙腈-水和純水淋洗對目標化合物回收率的影響。結(jié)果表明,純水淋洗效果較好,因此實驗采用1.0 mL純水進行淋洗。

2.3.2濃縮方式的選擇

實驗比較了濃縮和直接洗脫進樣對實驗結(jié)果的影響。取2份平行尿樣,分別加入等量的標準品,37 ℃恒溫避光酶解16 h,將酶解液通過固相萃取小柱富集、淋洗后,一份用1.0 mL甲醇進行洗脫、定容至1.0 mL后待測;另一份用5.0 mL甲醇洗脫,真空濃縮儀35 ℃濃縮至干后,1.0 mL甲醇溶解定容后待測。結(jié)果表明,直接洗脫進樣所測樣品的峰面積明顯高于濃縮后測定樣品。采用真空濃縮方式進行樣品濃縮時,1-OHN和2-OHN兩種物質(zhì)損失較為嚴重;用1.0 mL甲醇進行洗脫,定容至1.0 mL后測定,既省去了濃縮步驟,又可以達到良好的實驗效果。

2.4 方法學考察

2.4.1線性范圍和檢出限

本方法采用內(nèi)標法定量。向人工尿樣中加入系列混合標準溶液和內(nèi)標溶液,配制成質(zhì)量濃度分別為0、0.04、0.10、0.40、1.00、2.00、10.0、20.0 μg/L,內(nèi)標質(zhì)量濃度為2.00 μg/L的標準工作曲線。經(jīng)過與樣品相同的前處理后,在優(yōu)化的實驗條件下測定。2-OHN、1-OHN、3-OHF、2-OHF、3-OHP、2-OHP和1-OHP以3-OHP-13C6為內(nèi)標,1-OHPyr、3-OHC、6-OHC、1-OHBAA、3-OHBAA以6-OHC-13C6為內(nèi)標,進行定量計算。以被測組分質(zhì)量濃度為橫坐標(x, μg/L),被測組分定量離子峰面積與內(nèi)標物定量離子峰面積比為縱坐標(y),進行線性回歸分析,得到12種目標化合物的線性方程和相關(guān)系數(shù)。采用空白樣品中添加目標物的方法,以3倍信噪比(S/N)對應的質(zhì)量濃度確定檢出限(LOD), 10倍信噪比(S/N)對應的質(zhì)量濃度確定定量限(LOQ)。12種目標化合物在0.04～20.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)>0.99,方法檢出限為0.01～0.41 μg/L,定量限為0.04～1.35 μg/L。線性方程和檢出限見表2。

2.4.2回收率和精密度

取一實際尿樣,分別在高、中、低3個濃度水平下加標,每個加標樣品做6個平行樣。采用1.3.1節(jié)樣品前處理方法處理加標樣品,在最佳儀器條件下,依次進樣,將測試樣各組分的峰面積代入工作曲線的線性回歸方程,計算各組分的濃度。同樣條件處理樣品3批,進行測定。計算準確度、批內(nèi)精密度和批間精密度。準確度以加標回收率表示,批內(nèi)和批間精密度以相對標準偏差(RSD)表示。樣品平均回收率和精密度見表3。

2.5 實際樣品測定

采用本實驗條件和方法,對淮河流域某區(qū)域的100份人體尿樣進行了檢測,以期了解該地區(qū)不同人群的PAHs內(nèi)暴露水平。結(jié)果顯示,OH-PAHs的檢出率為98%,檢出率由高到低,分別為2-OHP、3-OHP、2-OHN、1-OHN、1-OHP和3-OHF & 2-OHF,其余物質(zhì)未檢出。以2-OHN為例,其檢出率為40%,檢出范圍為0.10～3.62 μg/L,四分位距為0.23 μg/L,結(jié)果詳見表4。

表 2 12種OH-PAHs的定量內(nèi)標、回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限和定量限

y: peak area ratio of quantitative ions of the measured component to the internal standard;x: mass concentration of the measured component, μg/L.

表 3 12種OH-PAHs在尿中3個水平下的加標回收率和精密度(n=6)

表 4 100份尿樣中12種OH-PAHs的檢測結(jié)果

*IQR: interquartile range.

3 結(jié)論

:

[1] Song X J, Li H Y, Yin M M, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2018, 36(1): 51

宋曉娟, 李海燕, 尹明明, 等. 色譜, 2018, 36(1): 51

[2] Wang M F, Yang L L, Hu E Y. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(6): 669

王美飛, 楊麗莉, 胡恩宇. 色譜, 2017, 35(6): 669

[3] Feng L, Zhang S J, Zhu G H, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(4): 466

馮利, 張勝軍, 朱國華, 等. 色譜, 2017, 35(4): 466

[4] Zhao B, Li Y Q, Zhang S K, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(9): 960

趙波, 黎玉清, 張素坤, 等. 色譜, 2014, 32(9): 960

[5] Li Z, Romanoff L C, Trinidad D A, et al. Anal Chem, 2006, 78(16): 5744

[6] Pang Y H, Ma Y, Cui Y, et al. Journal of Environment and Health, 2012, 29(6): 567

龐月紅, 馬蕓, 崔燕, 等. 環(huán)境與健康雜志, 2012, 29(6): 567

[7] Song X L, Hu X J, Lin S B. Journal of Environment and Health, 2017, 34(6): 555

宋喜麗, 胡小鍵, 林少彬. 環(huán)境與健康雜志, 2017, 34(6): 555

[8] Li Z, Romanoff L C, Trinidad D A, et al. Anal Bioanal Chem, 2014, 406(13): 3119

[9] Campo L, Mercadante R, Rossella F, et al. Anal Chim Acta, 2009, 631(2): 196

[10] Mattarozzi M, Musci M, Careri M, et al. J Chromatogr A, 2009, 1216(30): 5634

[11] Campo L, Rossella F, Fustinoni S. J Chromatogr B, 2008, 875(2): 531

[12] Romanoff L C, Li Z, Young K J, et al. J Chromatogr B, 2006, 835(1/2): 47

[13] Smith C J, Huang W, Walcott C J, et al. Anal Bioanal Chem, 2002, 372(1): 216

[14] Maisonnette C, Simon P, Hennion M C, et al. J Chromatogr A, 2006, 1120(1/2): 185

[15] Yang H M, Wang Y S, Li J H, et al. Applied Chemical Industry, 2014, 43(5): 957

楊紅梅, 王永生, 黎俊宏, 等. 應用化工, 2014, 43(5): 957

[16] Wang Y, Dong Y L, Fan R F, et al. Journal of Environment and Health, 2006, 23(1): 76

王宇, 董玉蓮, 范瑞芳, 等. 環(huán)境與健康雜志, 2006, 23(1): 76

[17] You F, Zhu L, He L, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2014, 42(12): 1723

游釩, 朱嵐, 何玲, 等. 分析化學, 2014, 42(12): 1723

[18] Chauhan A, Bhatia T, Singh A, et al. J Chromatogr B, 2015, 985: 110

[19] Ramsauer B, Sterz K, Hagedorn H W, et al. Anal Bioanal Chem, 2011, 399(2): 877

[20] Chen Y S, Wang S, Yu J J, et al. Tobacco Science & Technology, 2012(4): 37

陳玉松, 王昇, 余晶晶, 等. 煙草科技, 2012(4): 37

[21] Fan R F, Ramage R, Wang D L, et al. Talanta, 2012, 93(11): 383

[22] Zhao G, Chen Y, Wang S, et al. Talanta, 2013, 116(22): 822

[23] Li X X, Cui S W, He M F, et al. Chinese Preventive Medicine, 2012, 13(4): 246

李欣欣, 崔師偉, 何民富, 等. 中國預防醫(yī)學雜志, 2012, 13(4): 246

[24] Ding C M, Jin Y L, Lin S B. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2012, 40(3): 397

丁昌明, 金銀龍, 林少彬. 分析化學, 2012, 40(3): 397

[25] Huang C F, Yan H F, Pan Z F, et al. Journal of Hygiene Research, 2010, 39(3): 355

黃傳峰, 閆慧芳, 潘祖飛, 等. 衛(wèi)生研究, 2010, 39(3): 355

[26] Zheng L, Ding C M, Hu X J, et al. Journal of Environment and Health, 2011, 28(4): 348

鄭磊, 丁昌明, 胡小鍵, 等. 環(huán)境與健康雜志, 2011, 28(4): 348