周劭桓, 梁 川, 唐 陽, 廖艷華, 林文斯

(廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心, 廣西 南寧 530028)

紅薯也叫甜薯(sweet potato)或甘薯,在北緯40°和南緯32°間廣泛種植。目前我國(guó)是世界上最大的紅薯生產(chǎn)國(guó),年產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的80%[1]。在2005～2014年間,我國(guó)共鑒定紅薯品種106種[2]。廣西地處亞熱帶,適合紅薯生長(zhǎng),每年紅薯栽培面積約23.33萬公頃[3]。紅薯葉是紅薯產(chǎn)業(yè)中主要的副產(chǎn)物,在廣西每年可收獲四季,如能加工利用,對(duì)紅薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重大意義。

紅薯葉營(yíng)養(yǎng)豐富包含蛋白質(zhì)、粗纖維以及礦物質(zhì)等[4],同時(shí)還富含多種功效成分。已報(bào)道的功效成分包括單咖啡?？鼘幩?、雙咖啡酰奎寧酸、三咖啡?？鼘幩?、咖啡酸(CA)、芥子酸(SA)、槲皮素類以及類胡蘿卜素等[5-8]。許多研究表明,這些功效成分具有廣泛的生物活性[9,10]。但是目前仍沒有關(guān)于紅薯葉功效成分系統(tǒng)的研究報(bào)道。

在農(nóng)副產(chǎn)品的開發(fā)利用中,分析不同品種中功效物質(zhì)的含量是選擇優(yōu)勢(shì)品種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前針對(duì)植物中功效物質(zhì)的分析方法主要有高速逆流色譜法、超臨界流體色譜法、高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[11-13],其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法由于定性、定量準(zhǔn)確,已成為研究植物功效組分的重要分析方法。

本研究建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)分析紅薯葉中15種功效成分的方法。該方法快速、準(zhǔn)確、前處理簡(jiǎn)單,可快速分析紅薯葉中的功效成分。本研究發(fā)現(xiàn)了紅薯葉中3種未被報(bào)道的組分,并通過定性定量分析系統(tǒng)研究10種紅薯葉中的主要功效成分,發(fā)現(xiàn)可供開發(fā)的潛在優(yōu)勢(shì)品種,為紅薯產(chǎn)業(yè)深度利用開發(fā)、拓展紅薯產(chǎn)業(yè)鏈提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-30A超高效液相色譜儀(日本島津公司); AB-4000 Q TRAP三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司); KQ-800KDE超聲波清洗機(jī)(昆山超聲儀器有限公司); FDU-1200冷凍干燥機(jī)(日本Eyela公司); Milli-Q超純水處理儀(美國(guó)Millipore公司); 3k-15離心機(jī)(德國(guó)西格瑪公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品:3-咖啡?？鼘幩?綠原酸,3-CQA)、咖啡酸、芥子酸、奎寧酸(QA)、1-咖啡?？鼘幩?1-CQA)、4-咖啡酰奎寧酸(4-CQA)、5-咖啡酰奎寧酸(5-CQA)、3,4-二咖啡?？鼘幩?3,4-DiCQA)、3,5-二咖啡?？鼘幩?3,5-DiCQA)、4,5-二咖啡酰奎寧酸(4,5-DiCQA)、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷(quercetin 3-β-D-glucoside)、蘆丁(rutin)、楊梅素(myricetin)和木樨草素(luteolin)均為HPLC級(jí),購自美國(guó)Sigma公司;3,4,5-三咖啡酰奎寧酸(3,4,5-TrisCQA)購自成都曼思特生物科技有限公司。色譜純甲醇、乙腈購自德國(guó)Merck公司,其他分析純?cè)噭┚徸試?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

10個(gè)品種的紅薯葉采摘自廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,采摘時(shí)間為2017年5～8月。10個(gè)品種編號(hào)、名稱和顏色分別是:桂粉2號(hào)(S1,綠色)、觀賞紫秧(S2,紫色)、桂紫薇薯1號(hào)(S3,綠色)、心香(S4,綠色)、萬薯5號(hào)(S5,綠色夾雜紫色)、安哥拉白心薯(S6,綠色夾雜紫色)、桂經(jīng)薯2號(hào)(S7,綠色)、廣薯87號(hào)(S8,綠色)、越南黃心薯(S9,綠色)和觀賞黃秧(S10,黃色)。取新鮮紅薯葉,洗凈后,于-18 ℃冷凍干燥24 h,磨粉過40目篩,密閉封口袋,保存待用。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并配制成500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取0.20 mL各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于10 mL容量瓶中,用50%(v/v)甲醇水溶液定容,配制10 mg/L各標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別取0.2 mL各標(biāo)準(zhǔn)中間液,用50%(v/v)甲醇水溶液稀釋,定容至10 mL,得到質(zhì)量濃度為200 μg/L的各標(biāo)準(zhǔn)工作液。

分別取0.4 mL各標(biāo)準(zhǔn)中間液,用50%(v/v)甲醇水溶液稀釋,配制400 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;用50%(v/v)甲醇水溶液逐級(jí)稀釋,配制成質(zhì)量濃度為0.1～200 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱量1 g紅薯葉凍干粉末,加入15 mL 80%(v/v)甲醇水溶液,超聲波提取20 min后,以10 000 r/min離心10 min,移取上清液,重復(fù)提取3次,匯集上清液,用50%(v/v)甲醇水溶液定容至50 mL,取適量上清液,用50%(v/v)甲醇水溶液稀釋適量倍數(shù)后,過濾,待測(cè)。

1.4 分析條件

色譜柱為Phenomenex C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫為30 ℃;流動(dòng)相A為0.15%(v/v)甲酸水溶液;流動(dòng)相B為乙腈;流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～15 min, 10%B～40%B; 15～16 min, 40%B～80%B; 16～22 min, 80%B; 22.00～22.03 min, 80%B～10%B; 22.03～27.50 min, 10%B。進(jìn)樣體積5 μL。

離子源:ESI源,負(fù)離子模式;離子源溫度:550 ℃;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;電離電壓:-4.5 kV;霧化氣壓力:344 kPa;碰撞氣壓力:344 kPa;氣簾氣壓力:241 kPa。預(yù)四極桿入口電壓(EP): -10 V;碰撞室出口電壓(CXP): -13 V。15種功效成分的定性、定量離子對(duì)、解簇電壓(DP)和碰撞電壓(CE)見表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用美國(guó)AB公司分析軟件Analyst 1.6.2,所有樣本均重復(fù)測(cè)定3次,取平均值,結(jié)果均表達(dá)為平均值±SD。

表 1 15種化合物的質(zhì)譜參數(shù)

DP: declustering voltage; CE: collision energy; * quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

一般而言,如果待測(cè)化合物含有氨基,應(yīng)優(yōu)先考慮使用ESI+掃描模式;如果待測(cè)物含有強(qiáng)負(fù)電性基團(tuán),如-Cl、-OH等,需優(yōu)先考慮ESI-掃描模式;當(dāng)待測(cè)物酸堿性不明顯時(shí),兩種方式都要進(jìn)行嘗試。本次實(shí)驗(yàn)待測(cè)化合物大都帶有一個(gè)或多個(gè)-OH基團(tuán),具有一定酸性,更適合ESI-模式,但有些中性化合物如蘆丁等,在正離子模式下的響應(yīng)值會(huì)優(yōu)于負(fù)離子模式下的響應(yīng)值。因此實(shí)驗(yàn)首先采用針泵進(jìn)樣,測(cè)定不同化合物在正離子和負(fù)離子模式下的質(zhì)譜信號(hào)。結(jié)果顯示大多數(shù)待測(cè)化合物在ESI-模式下的響應(yīng)值較強(qiáng),蘆丁在ESI+與ESI-模式下的響應(yīng)值相差不大,但是紅薯葉提取液在ESI+掃描模式下受干擾較大。因此最終本實(shí)驗(yàn)采用ESI-模式分析待測(cè)化合物。

在負(fù)離子模式下,選擇出各化合物的母離子,對(duì)其進(jìn)行碰撞解離以獲得二級(jí)離子碎片,并對(duì)二級(jí)碎片離子進(jìn)行碰撞能量的優(yōu)化,選擇兩組干擾少、響應(yīng)值高的離子對(duì)作為定性離子和定量離子對(duì),優(yōu)化后的參數(shù)見表1。

實(shí)驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn),1-CQA、3-CQA、4-CQA和5-CQA均含有m/z為353.1、191.1、179.1和135.0的離子碎片;3,4-DiCQA、3,5-DiCQA和4,5-DiCQA均含有m/z為515.2、353.1、190.1和179.1的離子碎片。采用針泵進(jìn)樣在MRM模式下進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)這兩組同系物無法通過選擇離子來區(qū)分,還需進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件以達(dá)到分離要求。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

考察了甲醇-水和乙腈-水兩種不同流動(dòng)相體系對(duì)待測(cè)物分離效果的影響,結(jié)果顯示,大多數(shù)待測(cè)化合物在乙腈-水體系下峰形更為尖銳、清晰。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)酚酸類物質(zhì)在乙腈-水體系和甲醇-水體系下色譜峰均有拖尾現(xiàn)象,尤其是雙咖啡?？鼘幩犷惡腿Х弱？鼘幩?拖尾較為嚴(yán)重。嘗試在乙腈-水體系中加入體積分?jǐn)?shù)分別為0.05%、0.1%、0.15%和0.2%的甲酸,結(jié)果顯示,在乙腈-0.15%(v/v)甲酸水和乙腈-0.2%(v/v)甲酸水兩種流動(dòng)相條件下,各化合物的峰形清晰,基本無拖尾現(xiàn)象。考慮到在負(fù)離子模式下,過高的酸性環(huán)境可能對(duì)化合物的電離產(chǎn)生抑制效應(yīng),因此最終采用乙腈-0.15%(v/v)甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

在乙腈-0.15%(v/v)甲酸水流動(dòng)相體系下對(duì)100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，其總離子流圖色譜譜見圖1。由圖1可知,在本研究的色譜分離體系下,4種單咖啡酰奎寧酸同系物和3種雙咖啡?？鼘幩嵬滴锞艿玫搅己梅蛛x。

圖 1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中15種功效成分(100 μg/L)的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of the 15 functional components (100 μg/L) in the mixed standard solution Nos. 1-15 were the same as that in Table 1.

圖 2 樣品S9的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion current chromatogram of the sample S9Nos. 1-15 were the same as that in Table 1.

2.3 未知峰的分析

圖2為典型紅薯葉樣品(S9)的總離子流色譜圖。與圖1對(duì)比可知,S9樣品中含有11種已知的功效物質(zhì),分別為QA、5-CQA、3-CQA、4-CQA、CA、蘆丁、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷、3,4-DiCQA、3,5-DiCQA、4,5-DiCQA和3,4,5-TrisCQA,同時(shí)還含有未知化合物1(8.15 min)和未知化合物2(12.80 min)。

圖 3 (a)未知化合物1和(b)未知化合物2的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 3 MS/MS spectra of (a) unknown compound 1 and (b) unknown compound 2

針對(duì)這兩個(gè)未知化合物,進(jìn)一步采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)-條件判斷-增強(qiáng)離子掃描(MRM-IDA-EPI)模式掃描其二級(jí)子離子。MRM-IDA-EPI是三重四極桿質(zhì)譜儀一種特有的掃描方式,其實(shí)現(xiàn)方法為對(duì)某一組離子對(duì)在MRM模式下的響應(yīng)值進(jìn)行條件判斷,當(dāng)采集強(qiáng)度超過預(yù)設(shè)值后,將觸發(fā)EPI模式,從而獲得二級(jí)掃描圖譜。本實(shí)驗(yàn)對(duì)191.1/353.1和300.1/463.2兩組離子對(duì)進(jìn)行MRM-IDA-EPI掃描。在m/z50～800的掃描范圍內(nèi),未知化合物1和未知化合物2的二級(jí)質(zhì)譜圖分別見圖3a和圖3b。

未知化合物1母離子的m/z為353.1,子離子的m/z分別為135.1、179.1和191.1,均為單咖啡?？鼘幩岬牡湫头肿与x子,由于該化合物與4種單咖啡?？鼘幩岬某龇鍟r(shí)間均不相同,推斷其可能為單咖啡?？鼘幩岬耐之悩?gòu)體。

未知化合物2的質(zhì)譜圖與槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷類似,母離子的m/z為463.2,子離子具有槲皮素典型分子離子碎片(m/z為300.1和179.0),而且該物質(zhì)與槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷出峰時(shí)間十分接近。實(shí)驗(yàn)中嘗試通過改變流動(dòng)相體系及流動(dòng)相比例來分離這兩種物質(zhì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)不論如何改變均無法分離這兩個(gè)物質(zhì)(見圖4)。因此推測(cè)未知化合物2為槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷的異構(gòu)體,可能為槲皮素-3-α-D-葡萄糖苷。

圖 4 未知化合物2和槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷在不同流動(dòng)相條件下的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of the unknown compound 2 and quercetin 3-β-D-glucoside using different mobile phases Conditions: a. acetonitrile-0.15% (v/v) formic acid aqueous solution; b. acetonitrile-5mmol/L ammonium acetate; c. acetonitrile-5 mmol/L ammonium acetate-0.15% (v/v) formic acid aqueous solution. Peaks: 1. unknown 2; 2. quercetin 3-β-D-glucoside

CompoundLinearrange/(μg/L)LinearequationrLOD/(μg/L)Recovery/%RSD/%QA1.4-271.5Y=9.46×103X+4.56×1030.99970.1787.76.7Quercetin3-β-D-glucoside1.3-263.4Y=4.61×103X+2.37×1030.99980.1692.54.5Rutin1.4-281.5Y=1.60×104X+1.87×1030.99980.1591.43.6Myricetin1.3-263.5Y=1.07×103X+9.37×1020.99960.13103.63.9Luteolin1.3-259.5Y=1.06×103X+9.37×1020.99960.2695.45.01-CQA1.4-284.6Y=9.23×103X+6.00×1030.99980.2890.45.14-CQA1.3-252.5Y=1.64×103X+6.56×1030.99980.1382.24.83-CQA1.3-269.3Y=1.21×103X+3.56×1030.99970.1386.75.25-CQA1.4-271.4Y=2.12×103X+3.79×1030.99970.3494.56.5CA1.4-278.5Y=1.49×103X+2.41×1030.99950.64131.44.43,4-DiCQA1.3-261.0Y=1.60×104X+3.49×1030.99960.1396.78.33,5-DiCQA1.4-280.5Y=9.77×103X+4.23×1030.99970.1494.46.04,5-DiCQA1.3-252.0Y=2.21×104X-3.37×1030.99970.13104.25.7SA1.3-257.8Y=8.67×103X+6.74×1030.99980.6097.65.23,4,5-TrisCQA1.4-275.6Y=1.10×104X+1.01×1030.99970.2682.67.3

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.4 方法學(xué)考察

采用1.4節(jié)的分析條件,考察15種功效成分的線性關(guān)系、檢出限、回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(見表2)。由表2可知,15種功效成分在各自的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 5～0.999 8,方法的檢出限為0.13～0.64 μg/L。

以S9樣品為研究對(duì)象,針對(duì)可檢測(cè)出的組分,根據(jù)計(jì)算值,分別加入測(cè)定含量50%、80%、100%水平的化合物;對(duì)未檢測(cè)出的組分,按空白加標(biāo)方法加入不同水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),使其質(zhì)量濃度分別為5、10和20 μg/L。按1.3節(jié)和1.4節(jié)方法操作,測(cè)定平均回收率和精密度,結(jié)果見表2。可以看出,除咖啡酸的回收率明顯偏高(131.4%)外,其余各化合物的回收率(82.2%～104.2%)均在合理范圍內(nèi)。

2.5 實(shí)際樣品分析

利用本方法測(cè)定10個(gè)品種紅薯葉(S1～S10)中的功效成分,測(cè)定結(jié)果見表3。由表3可知,不同品種紅薯葉中各組分含量差異巨大,15種功效成分中,1-咖啡?？鼘幩?、楊梅素、木樨草素和芥子酸在所有樣品中均未檢出,蘆丁在部分樣品中有檢出。咖啡?？鼘庮愇镔|(zhì)是紅薯葉中的主要成分,占所測(cè)功效成分的35.1%～84.2%，其中3,5-二咖啡?？鼘幩嵩诓煌t薯葉品種中含量最高，為122.1～1 080.3 mg/100g。相比咖啡酰奎寧類物質(zhì),黃酮類物質(zhì)在紅薯葉中含量不高,僅占所測(cè)功效成分的0.4%～6.9%。

表 3 紅薯葉樣品中15種功能成分的測(cè)定結(jié)果(n=3)

The values were expressed as mean±SD. ND: not detected.

3 結(jié)論

本文建立了一種快速、高效分析紅薯葉功效物質(zhì)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。應(yīng)用本方法分析10個(gè)不同品種的紅薯葉,確定了紅薯葉富含的多酚類物質(zhì),其中咖啡奎寧酸類物質(zhì)是紅薯葉中的主要功效成分。對(duì)大多數(shù)品種而言,3,5-二咖啡酰奎寧酸和奎寧酸是紅薯葉中含量最高的兩種酚類物質(zhì)。本方法的建立為紅薯葉的開發(fā)利用及深度研究提供了技術(shù)支撐。

:

[1] Tang Z H, Wei M, Chen X G, et al. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(9): 1705

唐忠厚, 魏猛, 陳曉光, 等. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47(9): 1705

[2] Wang L J, Lei J, Su W J, et al. Hubei Agricultural Sciences, 2015, 54(12): 2844

王連軍, 雷劍, 蘇文瑾, 等. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 54(12): 2844

[3] Wu C R, Lu S Q, Li Y Q, et al. Guangxi Agricultural Sciences, 2010, 41(8): 845

吳翠榮, 盧森權(quán), 李彥青, 等. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 41(8): 845

[4] Sun H N, Mu T H, Xi L S, et al. Food Chem, 2014, 156: 380

[5] Jeng T L, Chiang Y C, Lai C C, et al. J Food Drug Anal, 2015, 23: 399

[6] Jeng J K, Lee S U, Kozukue N, et al. J Food Compos Anal, 2011, 24: 29

[7] Shekhar S, Mishra D, Buragohain A K, et al. Food Chem, 2015, 173: 957

[8] Isabel S C, Teresa C, Lara M C. Food Chem, 2010, 118: 384

[9] Alan C, Indu B J, Michael N C. Nat Prod Rep, 2009, 26(8): 965

[10] Lincoln W M, Rima A C, Ian B P, et al. Clin Exp Pharmacol P, 2000, 27: 152

[11] Ioana I, Irina V, Valentin I P. Food Chem, 2011, 126: 1821

[12] Zhang J, Wan H H, Zhang H. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(9): 963

張婧, 萬慧慧, 張華. 色譜, 2017, 35(9): 963

[13] Lai G Y, Wang L J, Lu H, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(5): 502

賴國(guó)銀, 王俐娟, 盧鶴, 等. 色譜, 2017, 35(5): 502