凌阿茹, 郭文博, 楊俊花, 趙志輝, 郭晉麗

(上海市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術研究所, 上海 201403)

黃曲霉毒素(aflatoxins, AFTs)是由寄生曲霉菌(aspergillusparasiticus)和黃曲霉菌(aspergillusflavus)等在適宜的溫度、濕度條件下產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,普遍存在于花生、玉米、小麥等谷物和糧油產(chǎn)品中[1]。至今已鑒定到的AFTs有20多種,其中關于黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)及其代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素M1(AFM1)、黃曲霉毒素M2(AFM2)的研究較多,以上AFTs均含有雙呋喃環(huán)和致癌性結構氧雜萘鄰酮[2]。雜色曲霉素(sterigmatocystin, SMC)是曲霉菌生物合成AFB1、AFG1等的前體物質(zhì),結構與AFTs極為相似,常協(xié)同污染谷物及糧油產(chǎn)品[3]。近年來多有研究[4,5]指出,真菌毒素中黃曲霉毒素的毒性最強,動物或人攝入較大劑量易引起急性中毒、肝炎、出血性壞死、肝細胞脂肪變性等,而持續(xù)微量攝入可造成慢性中毒,致癌、致畸及致突變等,嚴重時能引起肝硬化壞死、癌變甚至死亡[6,7]。1993年世界衛(wèi)生組織(WHO)癌癥研究機構將黃曲霉毒素列為Ⅰ級致癌物。此外也有研究表明,雜色曲霉素也具有腎臟和肝臟毒性,會造成動物肝細胞和腎小管上皮細胞壞死、肝硬化、中毒性肝炎等[8]。畜禽攝入被黃曲霉毒素或者雜色曲霉素污染的谷物飼料,不僅影響健康,還極易在動物源性產(chǎn)品(肉、奶、動物肝臟)中蓄積殘留,嚴重威脅人類健康。因此,建立一種靈敏、簡便、快速檢測黃曲霉毒素和雜色曲霉素殘留的分析方法非常必要。

動物源性組織中黃曲霉毒素的檢測手段主要有高效液相色譜法(HPLC)、薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等[9-16]。史瑩華等[9]采用免疫親和柱凈化,反相高效液相色譜法測定動物組織中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2,該方法凈化、衍生步驟復雜,前處理過程耗時,靈敏度低;薄層色譜法分析步驟復雜,不適宜大批量樣品的檢測[10];基于單克隆抗體或多克隆抗體的ELISA檢測對象單一,容易出現(xiàn)假陽性結果[11]。目前,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法已廣泛用于飼料、血漿、谷物、牛奶等不同基質(zhì)中黃曲霉毒素的分析檢測[12-15],其靈敏度高,檢測限低,確證和定量分析準確。孫雪等[16]建立了LC-MS/MS檢測豬肉、魚肉和豬肝中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2的方法,該方法采用免疫親和柱凈化,需大批量的樣本篩查和安全監(jiān)測,成本較高。因此,本研究在此基礎上,選用經(jīng)濟、簡單、快速、高效的QuEChERS前處理技術[17],結合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS),同時增加污染頻率較高、毒性僅次于AFTs的雜色曲霉素進行分析,旨在為動物源性產(chǎn)品中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的安全監(jiān)管提供便捷、高效、廣泛的技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和材料

ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜儀(美國Waters公司); TRIPLE QUAD 5500型三重四極桿質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司); Sorvall ST 16R型高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher公司); DC-24型氮氣吹干儀、2500 TH型超聲波清洗機(上海安普實驗科技股份有限公司); DMT-2500型多管式旋渦混勻儀(上海豫明儀器有限公司)。

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2和SMC標準品(純度≥99%, Romer國際貿(mào)易(北京)有限公司);β-葡萄糖苷酶(3 000 U/mg,上海泰坦科技股份有限公司)、甲醇、乙腈、乙酸銨和甲酸(色譜純,美國Merck公司);氯化鈉、無水硫酸鎂(上海埃彼化學試劑有限公司);正己烷(上海安譜科學儀器有限公司); 0.22 μm有機系濾膜(天津市津騰實驗設備有限公司);實驗用豬肉、豬肝、雞肉樣本均購自上海各超市及農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 溶液配制

稱取AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2和SMC標準品各1 mg,分別置于100 mL棕色容量瓶中,用乙腈配制成10 mg/L的標準儲備液,于-20 ℃避光保存;準確量取AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2和SMC標準儲備液各100 μL,分別置于10 mL棕色容量瓶中,用乙腈定容,配制成1 mg/L混合標準工作液,于-20 ℃避光保存。

取適量混合標準工作液,用5 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈(80∶20, v/v)進行稀釋,配制成質(zhì)量濃度為0.1、1、5、10、20、50、100 μg/L的系列溶劑標準溶液;分別量取適量混合標準工作液,加入豬肉、豬肝、雞肉組織的空白提取液進行稀釋,配制成質(zhì)量濃度為0.1、1、5、10、20、50、100 μg/L的系列基質(zhì)標準溶液。

稱取β-葡萄糖苷酶5 mg,用1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成5 g/L(15 000 U/mL)β-葡萄糖苷酶緩沖液;稱取0.197 2 g乙酸銨冰晶,用500 mL超純水配制成5 mmol/L乙酸銨溶液。

1.3 實驗條件

1.3.1樣品前處理

將豬肉、雞肉和豬肝臟樣品分別絞至勻漿狀,分裝好后于-20 ℃保存,測定前于4 ℃解凍。

準確稱取(2.00±0.05) g樣品,置于50 mL離心管中,加入20 μLβ-葡萄糖苷酶緩沖液和1.6 mL水,渦旋混勻,于37 ℃酶解12 h,加入8.4 mL乙腈,渦旋均勻,于40 ℃超聲40 min,然后以2 000 r/min渦旋30 min,再分別加入NaCl 1.0 g和無水MgSO41.0 g,最后加入5 mL正己烷脫脂,渦旋均勻,以5 000 r/min離心10 min,取5 mL中層清液于10 mL離心管中,于40 ℃水浴氮氣吹干;加入1 mL 5 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈(80∶20, v/v)復溶,過0.22 μm有機系濾膜,待上機檢測。

1.3.2液相色譜條件

色譜柱:Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×3.0 mm, 2.7 μm);柱溫:40 ℃;進樣室溫度:25 ℃;流動相A:甲醇;流動相B: 5 mmol/L乙酸銨溶液;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 10%A; 1.0～6.0 min, 10%A～90%A; 6.0～6.5 min, 90%A; 6.5～6.7 min, 90%A～10%A; 6.7～8.0 min, 10%A。進樣體積:5 μL。

1.3.3質(zhì)譜條件

離子化模式:電噴霧正離子模式(ESI+);質(zhì)譜掃描模式:多反應監(jiān)測(MRM)模式;離子源溫度:150 ℃;掃描范圍(m/z): 100～800;各離子對駐留時間:100 ms;毛細管電壓:2.5 kv;錐孔電壓:25 v;干燥氣溫度:500 ℃;干燥氣流速:1 000 L/h。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素在多反應監(jiān)測模式下的質(zhì)譜參數(shù)

*Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的優(yōu)化

6種黃曲霉毒素的化學結構相似,易溶于醇類、丙酮、氯仿等有機溶劑,難溶于水和正己烷等[4]。常見的提取溶劑有乙腈-水、乙腈-乙酸-水、甲醇-水、氯仿等,且混合提取溶劑的比例不同提取結果也存在差異。本實驗對添加了50 μL 1 mg/L混合標準工作液的豬肉樣品(即添加水平25 μg/kg)進行前處理,比較乙腈-水(84∶16, v/v)、乙腈-水(90∶10, v/v)、乙腈-水(50∶50, v/v)、乙腈-水-乙酸(79∶20∶1, v/v/v)4種不同提取溶劑對6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素回收率的影響,結果見圖1。不同提取溶劑對6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的回收率存在顯著差異(p<0.05),當乙腈和水的體積比為84∶16時,6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的回收率均最高,為97.6%～118.5%。同時對雞肉和豬肝樣品進行考察也獲得了相同的結果。因此本實驗選用乙腈-水(84∶16, v/v)進行提取。

圖 1 不同提取溶劑對6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素回收率的影響(n=3)Fig. 1 Influence of different extract solvents on the recoveries of the six AFTs and SMC (n=3)

2.1.2酶的選擇

Mabee和Chipley[18]通過觀察雞肉體內(nèi)14C-AFB1的組織分布與代謝途徑發(fā)現(xiàn)14C-AFB1的代謝產(chǎn)物14C-AFM1在雞肉組織中與葡萄糖苷酸以共軛物的形式存在,并且檢測結果顯示,經(jīng)β-葡萄糖苷酶酶解后的樣品中有31.5%的14C都來源于該共軛物所釋放的葡萄糖苷酸綴合物。曹曉琴[4]先利用β-葡萄糖苷酶酶解豬、牛、羊的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織,再對黃曲霉毒素進行提取檢測,其回收率較高。因此,本實驗最終選擇β-葡萄糖苷酶對畜禽組織進行酶解。分別制備加標豬肉、豬肝、雞肉樣品(25 μg/kg),各加標樣品酶解前后的提取效果見圖2。由圖2可知,3種加標樣品在經(jīng)β-葡萄糖苷酶酶解后6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的回收率均高于未酶解的樣品。表明酶解有助于6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的游離,使結果更準確，同時研究發(fā)現(xiàn)酶解使復溶液更容易過濾,上機樣品也更澄清。

圖 2 酶解前后不同加標樣品中6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的回收率(n=3)Fig. 2 Recoveries of the six AFTs and SMC in different spiked samples with and without enzymatic hydrolysis (n=3)

2.2 色譜條件的優(yōu)化

為了使結構類似的黃曲霉毒素和雜色曲霉素能夠有效分離,本研究選用分離性能較好的Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱(100 mm×3.0 mm, 2.7 μm),并比較了在不同流動相(乙腈-水、甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液、甲醇-0.1%(v/v)乙酸水溶液和甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液)和不同洗脫梯度條件下各黃曲霉毒素和雜色曲霉素的響應值和峰形。結果顯示,在水相中加入5 mmol/L乙酸銨時6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的響應值較高,分離度好,峰形尖銳。因此最終選擇甲醇和5 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實驗通過直接進樣方式對質(zhì)譜條件進行優(yōu)化。由于黃曲霉毒素和雜色曲霉素屬于中等極性物質(zhì),所以采用電噴霧離子源進行離子化,并且在正離子模式下進行母離子全掃描。結果表明,黃曲霉毒素和雜色曲霉素均生成[M+H]+基峰離子,以此為母離子進行子離子掃描。通過兩者之間信號強度的比較,優(yōu)化母離子、定量子離子、去簇電壓、碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù),得到優(yōu)化后的最佳質(zhì)譜參數(shù)。

2.4 基質(zhì)效應的考察

畜禽組織成分復雜,含有許多蛋白質(zhì)等大分子化合物,極易對質(zhì)譜離子化產(chǎn)生影響。為了保證實驗的準確性,分別建立溶劑標準曲線和基質(zhì)標準曲線,考察豬肉、豬肝、雞肉不同基質(zhì)對提取效果的影響。本實驗分別制備了3種樣品的空白基質(zhì)溶液,用于基質(zhì)效應的考察和方法學驗證。對質(zhì)量濃度為0.1、1、5、10、20、50、100 μg/L的系列溶劑標準溶液和基質(zhì)標準溶液依次進行測定,以質(zhì)量濃度為橫坐標、相應的峰面積為縱坐標繪制溶劑標準曲線和基質(zhì)標準曲線。根據(jù)Matuszewski等[19]的描述,用信號增強或抑制的程度(SSE)來評價基質(zhì)效應,計算公式如下:

SSE=(S1/S2)×100% (1)

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

其中,S1和S2分別表示樣品基質(zhì)和溶劑標準曲線的斜率。SSE值的正常范圍為80%～120%,當其高于120%時顯示信號增強效應,當其低于80%時顯示信號抑制效應[20]。不同畜禽組織對6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素提取效果的干擾情況見表2。

由表2可知,豬肉基質(zhì)對AFB2和AFM2有一定的抑制作用,其他4種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的SSE值均在80%～120%之間;豬肝和雞肉基質(zhì)對部分毒素有一定的干擾效應,其SSE值>120%或<80%。因此,為了保證檢測結果的準確性,選擇基質(zhì)匹配標準曲線進行定量分析。

表 2 不同畜禽組織中6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的基質(zhì)效應

2.5 方法學驗證

2.5.1線性關系、檢出限和定量限

對質(zhì)量濃度為0.1、1、5、10、20、50、100 μg/L的系列基質(zhì)標準溶液進行分析,建立基質(zhì)標準曲線(見表3)。分別根據(jù)定性離子通道中信噪比(S/N)=3和定量離子通道中S/N=10計算方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結果見表3。

由表3可知,不同基質(zhì)標準溶液中6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素在線性范圍0.1～100 μg/L內(nèi),相關系數(shù)均>0.99,參考2002/657/EC標準,說明本方法線性關系良好。豬肉、豬肝、雞肉基質(zhì)標準溶液中黃曲霉毒素及雜色曲霉素的檢出限分別為0.007～0.30、0.01～0.15和0.01～0.27 μg/kg,定量限分別為0.02～0.80、0.03～0.49和0.02～0.91 μg/kg,說明本方法靈敏度高,可用于不同畜禽樣品的定性和定量分析。

2.5.2回收率

稱取(2.00±0.05) g空白樣品,分別加入2、10和50 μL 1 mg/L混合標準溶液(即加標水平分別為1、5和25 μg/kg),每個水平做6個平行樣品,靜置10 min,依次對樣品進行提取處理和色譜-質(zhì)譜分析。根據(jù)檢測結果計算回收率和相對標準偏差(RSD),結果見表4。在3個添加水平下,3種不同基質(zhì)中6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的回收率為77.3%～118.5%,相對標準偏差(RSD)為1.5%～19.9%。

表 4 豬肉、豬肝和雞肉樣品中6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的回收率和精密度(n=6)

2.6 實際樣品分析

通過本文建立的UHPLC-MS/MS方法對從各超市及大型農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場采購的127份樣品(1～33號為豬肉樣品、34～54號為豬肝樣品、55～127號為雞肉樣品)中6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素進行定量分析。127份樣品中有10份檢出黃曲霉毒素或雜色曲霉素,其中雜色曲霉素SMC的檢出率最高,污染率為7.08%,含量為0.118～0.798 μg/kg; AFM1和AFM2未檢出;其中只有27號豬肉樣品同時檢出了AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和SMC,含量為0.118～0.458 μg/kg,表明畜禽產(chǎn)品中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的殘留量較低,其中主要以SMC殘留為主。

3 結論

本文建立了以QuEChERS前處理技術為基礎同時測定畜禽組織中6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的UHPLC-MS/MS定量分析方法。方法操作簡單,靈敏度高,準確性好,穩(wěn)定可靠,適用于畜禽組織中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的確證和定量分析,同時可為建立檢測畜禽組織中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的國家標準方法和畜禽產(chǎn)品當中真菌毒素的風險監(jiān)控提供參考。

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