劉厚明，陳 珊，黃莎莎，單萬水

(1 深圳市第三人民醫(yī)院，廣東 深圳 518112；2廣東醫(yī)科大學，廣東 湛江 524002)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染引起的一種對人類健康危害嚴重的慢性傳染病。2015年全球新增結(jié)核病例1 040萬，新增耐多藥結(jié)核病例48萬，超半數(shù)來自印度、中國和俄羅斯[1]。結(jié)核病是2016年傳染性疾病中排名第一的死亡原因[2]。我國現(xiàn)有427萬活動性肺結(jié)核患者，是全球30個結(jié)核病高負擔國家之一，新發(fā)結(jié)核病病例位居全球第三，新增耐多藥結(jié)核患者數(shù)居全球第二[3]。耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)是指結(jié)核病患者感染的MTB至少同時對利福平(rifampicin, RFP)和異煙肼(isoniazid, INH)產(chǎn)生耐藥性[4]。2015年我國每10位結(jié)核病患者中僅有3位得到準確診斷，每100位MDR-TB患者僅有5位獲得有效治療[5]。目前，快速檢測MTB耐藥相關基因的方法在全球范圍內(nèi)日益增多，國內(nèi)各地區(qū)積極開展研究地區(qū)耐藥基因突變特征，以期獲得快速分子檢測信息。本研究通過基因測序法分析結(jié)核分枝桿菌RFP耐藥相關基因rpoB和INH耐藥相關基因katG、inhA啟動子的突變情況，探討某院耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株ropB、katG 和inhA 基因突變特征及其與耐藥性的相互關系，為新興MDR-TB分子診斷技術在本地區(qū)的應用提供理論支撐，也為該院制定耐藥結(jié)核病防治規(guī)劃提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2012年8月—2014年5月某市傳染病?？漆t(yī)院住院患者送檢痰標本分離培養(yǎng)的MTB 83株，菌株來源包括新發(fā)和復發(fā)患者，年齡為15～77歲；男性56例，女性27例。所有MTB DNA標本均保存于-70℃冰箱并統(tǒng)一進行相關耐藥基因突變位點檢測。

1.2 研究方法

1.2.1 菌株分離鑒定及藥敏試驗 嚴格按照國家結(jié)核病細菌學檢驗標準化規(guī)程進行試驗，標本用BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)儀培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性的菌株進行抗酸染色，利用實時熒光定量PCR進行菌種鑒定。采用世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的比例法對RFP、INH、鏈霉素和乙胺丁醇進行敏感性試驗，4種藥物在培養(yǎng)基中的臨界濃度分別為1、0.1、1和5 mg/L，根據(jù)待測管與空白對照管中分枝桿菌的生長情況對比判斷該藥的敏感性，結(jié)果判讀為耐藥(R)或敏感(S)。

1.2.2 細菌DNA的制備 吸取一定量的液體培養(yǎng)基中生長的MTB，在80℃恒溫箱中滅活60 min，使用 Qiagen公司的細菌基因提取試劑盒提取基因組DNA，操作按說明書進行。

1.2.3 引物設計與合成 通過https://www.ncbi.nlm.nih.gov/的genebank獲得標準株H37RvrpoB、katG和inhA基因全序列，采用primer premier 5.0設計引物，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.2.4 目的基因的擴增與測序 PCR反應體積為50 μL，包括3 μL模板，5 μL 10× LA PCR Buffer II，2.5 μL引物，8 μL dNTP混合液，0.5 μL Taq PCR master mix，31 μL去離子水。擴增條件： 94℃變性1 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃210 s，30個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物送華大基因公司進行純化和測序，測序結(jié)果與MTB標準株H37Rv序列比對分析。

1.3 統(tǒng)計分析 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計數(shù)資料采用χ2檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果 收集的83株MTB臨床樣本中，耐藥株60株，全敏感株23株。其中RFP耐藥株39株，敏感株44株；INH耐藥株51株，敏感株32株；對RFP及INH同時耐藥30株。

2.2 RFP耐藥相關基因rpoB的突變特征 39株RFP耐藥株中有38株檢測到rpoB基因突變，突變率達97.44%(38/39)，其中36株在rpoB基因81bp的基因核心區(qū)域內(nèi)發(fā)生突變，2株在1 156位點發(fā)生突變。測序結(jié)果顯示，39株RFP耐藥株中共發(fā)現(xiàn)19種突變形式，其中9種為本研究新發(fā)現(xiàn)的突變類型，主要包括兩個以上密碼子聯(lián)合突變、點突變、同一密碼子雙重突變，未發(fā)現(xiàn)堿基插入或缺失。突變菌株中單位點突變有6株(15.79%)，多位點聯(lián)合突變有32株(84.21%)。最常見的突變位點為531位點，突變率達60.53%(23/38)，變化形式主要由組氨酸(His)突變?yōu)榱涟彼?Leu)或酪氨酸(Tyr)；其次的突變位點為526位點，突變率為23.68%(9/38)。44株RFP敏感菌株中有31株檢測到突變，其中1 156位點同義突變占80.65%(25/31)。見表2。

表2 83株MTB RFP耐藥相關基因rpoB突變特征

注：NMa為無基因突變；b為TBDReaMDB結(jié)核分枝桿菌數(shù)據(jù)庫(http://www.tbdreamdb.com)中未報道位點；c為氨基酸同義突變，該位點在TBDReaMDB結(jié)核分枝桿菌數(shù)據(jù)庫中未見報道；突變前后改變氨基酸使用一字碼簡寫；TBDReaMDB結(jié)核分枝桿菌數(shù)據(jù)庫查詢?nèi)掌跒?017年7月25日

2.3 INH耐藥相關基因katG、inhA的突變特征 98.04%(50/51)的INH耐藥株在katG基因出現(xiàn)突變，其中14株為單位點突變，36株存在多位點聯(lián)合突變。14株單位點突變菌株中，有8株為katG 315位點突變；36株多位點聯(lián)合突變菌株中，有27株為katG 315位點突變；katG 315位點突變率為70.00%(35/50)。32株INH敏感菌株中未發(fā)現(xiàn)katG 315位點突變。katG 463位密碼子在耐藥株和敏感株中均檢測到突變，突變率分別為74.51%(38/51)、59.38%(19/32)，兩者突變率比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.09，P=0.15)。51株INH耐藥株中僅1株檢測到inhA 21位點突變，且為inhA 21位點與katG 463位點聯(lián)合突變，其余50株分離株inhA 21位點基因序列與標準株H37Rv序列均一致；INH敏感株未檢測到inhA 21位點基因突變。見表3。

表3 83株MTB分離株katG、inhA基因突變情況

*：為inhA基因上的密碼子；NMa為無基因突變；b為TBDReaMDB結(jié)核分枝桿菌數(shù)據(jù)庫(http://www.tbdreamdb.com)中未報道位點；c為氨基酸同義突變，該位點在TBDReaMDB結(jié)核分枝桿菌數(shù)據(jù)庫中未見報道；突變前后改變氨基酸使用一字碼簡寫；TBDReaMDB結(jié)核分枝桿菌數(shù)據(jù)庫查詢?nèi)掌跒?017年7月25日

3 討論

21世紀以來，隨著耐藥MTB的出現(xiàn)和傳播，全球結(jié)核病疫情呈現(xiàn)死灰復燃的態(tài)勢，耐藥結(jié)核病患者尤其是耐多藥及廣泛耐藥性結(jié)核病患者逐年增加，給公共衛(wèi)生安全帶來嚴重威脅。INH和RFP作為目前使用最廣泛的一線抗結(jié)核藥物，在MTB耐藥譜中高居前2位[6]，而INH和RFP較高耐藥率的出現(xiàn)，主要與其耐藥基因突變相關[7]。全國各地區(qū)關于MTB耐RFP和INH相關基因的突變頻率存在差異，因此，以地區(qū)為單位研究MTB耐藥基因的突變特征對各地區(qū)開展結(jié)核病防治工作有重大意義。

rpoB是MTB RNA聚合酶β亞單位的編碼基因，長約3 534 bp，編碼1 178個氨基酸。大量研究[8-9]表明，90%～97%耐RFP的MTB是由rpoB基因內(nèi)的RFP耐藥基因核心區(qū)(rifampicin resistance determining region，RRDR)發(fā)生突變引起。本研究結(jié)果顯示，83株MTB中有39株出現(xiàn)RFP耐藥，RFP耐藥率為46.99%，耐RFP菌株中檢測到rpoB基因RRDR區(qū)域內(nèi)突變36株，突變率達92.31%(36/39)。本研究中不計入同義突變類型，最常見的突變位點是531、526位點，突變頻率分別為60.53%(23/38)和23.68%(9/38)，兩位點突變頻率之和占84.21%(32/38)；其中531位點突變頻率高于湖南報道的51.1%[10]和江蘇報道的55.4%[11]，低于新疆地區(qū)報道的73.6%[12]，說明地區(qū)間rpoB 531突變頻率存在一定差異。此外，發(fā)現(xiàn)有3株菌在RRDR區(qū)內(nèi)出現(xiàn)雙堿基突變，以rpoB 511和516位點、rpoB 516和526位點以及rpoB 526和533位點聯(lián)合突變的形式存在，考慮可能rpoB 511、516和533位點突變與RFP低濃度耐藥有關[13]。RRDR區(qū)域外發(fā)現(xiàn)2個同義突變位點D382D和A1156A，可能與RFP耐藥無關[14]。本研究還檢測到10個未被TBDReaMDB結(jié)核分枝桿菌數(shù)據(jù)庫收錄的E162G、T240P、G317D等位點，這些位點以與RRDR區(qū)的rpoB 531、526、516、511等位點聯(lián)合突變的形式存在，分析這種聯(lián)合突變類型中RRDR區(qū)的突變位點可能對MTB耐RFP起主導作用，區(qū)域外與之聯(lián)合突變的位點與RFP耐藥的相關性并不明確，也許有協(xié)同作用，也可能與RFP耐藥無關，尚待日后研究。本研究中發(fā)現(xiàn)MTB耐RFP以rpoB 531位點突變?yōu)橹?，其次?26位點，與2012年廣東地區(qū)報道[15]rpoB基因突變特征相似，說明檢測此兩位點存在突變與否可以作為該地區(qū)MTB對RFP耐藥性的分子診斷依據(jù)。

INH是前體藥物，通過被動擴增進入MTB菌體內(nèi)，能抑制細胞壁分枝菌酸的合成，從而破壞其完整性以達到殺菌目的。INH耐藥機制復雜，涉及katG酶、烯酰脂酰載體蛋白還原酶(inhA)、β-酮?；\載蛋白合成酶(kasA)、烷基過氧化氫還原酶(ahpC)和還原型輔酶I脫氫酶(ndh)等基因。據(jù)研究報道， 85%以上INH耐藥株存在katG基因和inhA-15位點突變[16-18]。本研究中，83株MTB菌株有51株耐INH，耐藥率為61.45%，檢測到katG基因序列突變?yōu)?0株，突變率為98.04%(50/51)，僅1株檢測到inhA突變，表明katG基因突變與INH耐藥相關。本次測序結(jié)果顯示，katG 315位點突變率為70.00%(35/50)，且存在katG 315突變的均為INH耐藥株，說明在該院可將katG 315突變作為快速檢測MTB對INH耐藥性的一個可靠標志。同時，INH耐藥株中還檢測到katG基因P100T、V196I、W191G 等8個未被TBDReaMDB結(jié)核菌數(shù)據(jù)庫收錄的突變位點，除多態(tài)性位點、同義突變和聯(lián)合突變，W191G、A264V、P325S、Y608D、G490D、N508D位點均屬單堿基有效突變，以上位點可能與INH耐藥相關，但需更多數(shù)據(jù)和相關研究證實。

inhA 基因最常見的突變位點是inhA-15和inhA-8位點，inhA 啟動子突變被證實與INH 低濃度耐藥相關[19]。本實驗中僅1株出現(xiàn)inhA基因突變，占突變株的2.00%(1/50)，低于Zhou等[20]的研究結(jié)果，與Tseng等[21]的研究結(jié)果相似，由此推測耐藥株中inhA基因突變具有地域差異性，在該院inhA基因的突變頻率偏低，但也不排除是因樣本量較少所致。除此之外，本實驗在INH耐藥株和敏感株中均檢測到katG 463(CGG-CTG)突變，據(jù)報道katG463突變是自然存在的基因多態(tài)性位點，與INH耐藥性無關[22]。

本實驗采用BD MGIT 960 RISE比例法和DNA測序法對本院耐RFP和INH的MTB相關基因的突變情況進行分析，發(fā)現(xiàn)30株耐多藥菌株均發(fā)生rpoB和katG基因聯(lián)合突變，說明rpoB和katG基因存在協(xié)同作用，同時發(fā)生突變可導致MTB對RFP和INH產(chǎn)生耐藥，且有報道[23]指出90%～95%耐RFP的MTB菌株同時耐INH，單獨對MTB進行RFP耐藥性分析可初步鑒定MDR-TB 。另外，61株耐藥株中仍有2株未檢測到相關基因突變，提示這些菌株的突變點可能出現(xiàn)在本實驗擴增的相關基因區(qū)域外，或是由其他耐藥機制引起，比如異源性耐藥等。一些MTB耐藥基因突變位點與表型耐藥之間的關系并不十分明確，仍需繼續(xù)研究以提高基因檢測的特異性和靈敏度。

總之，MTB耐藥基因突變情況存在地域差異，可能受樣本量大小和抽樣方式、人群遺傳背景、菌株進化背景以及環(huán)境等因素影響。醫(yī)院可通過篩檢rpoB基因的RRDR區(qū)域、katG基因高頻突變點作為初步快速判斷耐多藥MTB耐藥性的方法之一。

[參 考 文 獻]

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