劉美霞，趙靜，王青川，張炳春，楊柯

中國科學(xué)院 金屬研究所，遼寧 沈陽 110016

引言

生物醫(yī)用金屬材料具有高強度、良好的韌性、良好的抗疲勞性能和優(yōu)異的加工成型性，并且具有優(yōu)異的抗腐蝕性能和良好的生物相容性，被廣泛用于制造各類臨床植入體[1]。316L不銹鋼（316LSS）和鈷鉻合金（L605）是臨床中應(yīng)用最廣泛的心血管支架材料，但其中都含有9wt.%以上的鎳（Ni）元素。大量臨床實驗證明，Ni是一種潛在的致敏因子，鎳離子在生物體內(nèi)富集可能會誘發(fā)毒性效應(yīng)，導(dǎo)致細胞破壞和炎癥反應(yīng)，對生物體有致畸、致癌的潛在危害[2-5]。因此，降低材料中Ni的含量是提高材料生物相容性的重要手段。

隨著對材料中Ni的含量要求越來越嚴(yán)格，早在20世紀(jì)90年代國內(nèi)外就已經(jīng)開展了高氮無鎳不銹鋼的研究和開發(fā)工作。1996年Menzel等[6]對高氮無鎳奧氏體鋼在醫(yī)療領(lǐng)域中應(yīng)用的可行性進行了分析，對Fe-18Cr-18Mn-2Mo-1N高氮無鎳不銹鋼的組織和性能進行了全面研究。同時，通過降低鋼中的Cr和Mn含量，適當(dāng)提高Mo含量，開發(fā)出Fe-15Cr-(10-15)Mn-4Mo-0.9N高氮無鎳醫(yī)用不銹鋼[7]。近年來，美國、日本、加拿大等國家對高氮無鎳不銹鋼在骨科及心血管方面的應(yīng)用也開展了相關(guān)研究[8-12]。以上研究均表明，較傳統(tǒng)不銹鋼316L SS，高氮無鎳不銹鋼具有更加優(yōu)異的力學(xué)性能、耐蝕性能及生物相容性。在國內(nèi)，中國科學(xué)院金屬研究所楊柯研究員領(lǐng)導(dǎo)的生物材料課題組首次研發(fā)出一種新型高氮無鎳不銹鋼（High Nitrogen Nickel-Free Stainless Steel，HNNFS）心血管支架材料，目前已經(jīng)取得突破性進展[13]。本文開展HNNFS與L605、316LSS的生物相容性對比研究，通過溶血及細胞增殖等實驗，對3種材料的血液相容性以及對血管平滑肌細胞的增殖作用進行評價，為HNNFS在心血管支架領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料制備

本實驗將HNNFS作為實驗材料，將L605和316LSS作為對比材料。將樣品加工成直徑為10 mm，厚度為1 mm的薄片，經(jīng)水磨砂紙逐級打磨拋光后，酒精超聲清洗并吹干。實驗前，將樣品在121℃高溫下滅菌20 min，烘干后備用。

1.2 溶血率實驗

本實驗嚴(yán)格依照GB/T 16886.4的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[14]。實驗用血為沈陽血液中心提供的新鮮人血，并添加抗凝劑。每種樣品設(shè)置5個平行樣，分別置于離心管中，按照樣品面積與溶液體積為3 cm2/mL的比例分別加入1 mL的0.9%NaCl溶液，陰性對照為同體積的0.9% NaCl溶液，陽性對照為同體積的蒸餾水。將所有樣品放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，按照0.2 mL/10 mL加入稀釋人血（人血與0.9% NaCl以4：5比例稀釋）。在恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)

60 min后，經(jīng)3000 r/min速率離心5 min后取上清液，并加入至96孔板中，用酶標(biāo)儀在545 nm波長處測量光密度（OD）值。溶血率計算公式如下：

式中：OD實驗組——實驗組樣品的吸光度值；OD陰性組——陰性對照的吸光度值；OD陽性組——陽性對照的吸光度值。

1.3 細胞培養(yǎng)

實驗中采用人臍動脈平滑肌細胞（HUASMC），對材料與細胞的相互作用展開研究。HUASMC購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。將細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（BI，美國）和0.5%青鏈霉素（Gibico，美國）的1640培養(yǎng)基（Hyclone，中國）中，并置于含5%CO2，37℃/95%濕度條件的培養(yǎng)箱中，待細胞生長覆蓋培養(yǎng)皿的80%時傳代。加入含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞并收集細胞至5 mL離心管中，1000 rpm離心5 min后，棄上清液，加入一定量培養(yǎng)基備用。

1.3.1 材料對HUASMC增殖率的影響

將材料置于48孔板中，取濃度為1×104/mL的細胞懸液100 μL接種于樣品表面，培養(yǎng)8 h待細胞貼壁后，加入1640培養(yǎng)基，并培養(yǎng)1、3和5 d，同時設(shè)置陰性對照（完全培養(yǎng)基）。到了既定時間點，加入含EDTA的0.25%胰蛋白酶將樣品表面細胞消化下來，1000 rpm離心5 min后，棄凈上清液，加入100 μL 1640培養(yǎng)基重懸細胞后加入至96孔板中，加入10 μL MTS（Signalway，美國），在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后，在酶標(biāo)儀490 nm波長下測量OD值，并計算細胞相對增殖率（Relative Growth Rate，RGR），計算公式為：

式中：OD實驗組是實驗組吸光度值；OD陰性組是陰性對照組吸光度值。

1.3.2 材料對HUASMC黏附的影響

將實驗材料置于48孔板中，取濃度為1×104/mL的細胞懸液接種于材料表面，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、3和5 d。達到既定時間后，取出樣品，經(jīng)PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定細胞15 min，PBS再次浸洗3次后，使用DAPI（碧云天，中國）對細胞核進行染色，并在熒光顯微鏡（BK-6000，中國）下拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。每種材料測試3個以上樣品，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用ANOVA方法進行整體性差異評價，方差齊性用LSD法進行組間比較；方差不齊用Dunnett’s T3法進行組間比較，P＜0.05為具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05為無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 溶血率

3種材料的溶血率（圖1）均小于5%。根據(jù)國標(biāo)可知，若材料的溶血率＜5%，則說明材料符合醫(yī)用材料的溶血試驗要求，若溶血率≥5%，則說明材料有溶血作用。由此可見，3種材料均符合醫(yī)用材料的溶血試驗要求，且HNNFS的溶血率明顯低于316L SS，與L605無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖1 HNNFS與L605、316LSS的溶血率

2.2 材料對HUASMC的影響

2.2.1 細胞相對增殖率

HUASMC分別在HNNFS、L605及316LSS表面上共培養(yǎng)1、3、5 d后，細胞的相對增殖率結(jié)果，見圖2。由圖可知，培養(yǎng)1 d時，3種材料表面細胞增殖率相近；當(dāng)培養(yǎng)3 d后，HNNFS表面細胞相對增殖率明顯低于L605和316LSS，體現(xiàn)出了優(yōu)異的抑制平滑肌細胞增殖的能力。

2.2.2 細胞黏附

HUASMC在3種材料表面培養(yǎng)1、3、5 d后的黏附情況，見圖3。隨著培養(yǎng)時間的延長，HUASMC在L605及316LSS表面數(shù)量增加，表明細胞不斷在材料表面增殖；而HNNFS表面黏附的細胞數(shù)量明顯減少，展示了其對HUASMC增殖具有明顯的抑制作用。

采用Image J軟件，對每個實驗樣品隨機選擇5個視野計數(shù)，并進行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)HNNFS與L605和316L SS表面粘附的細胞數(shù)量與細胞增值率結(jié)果趨于一致，結(jié)果見圖4。

圖2 HNNFS與L605、316LSS對HUASMC增殖率的影響

圖3 HUASMC在HNNFS與L605、316LSS表面的粘附情況

圖4 HUASMC在HNNFS與L605、316LSS表面的粘附數(shù)量

3 討論

溶血試驗是評價生物醫(yī)用材料血液相容性最基本的方法。當(dāng)生物材料植入人體與血液接觸后，材料表面與紅細胞接觸后造成細胞膜的損害，血紅蛋白釋放到血漿中，發(fā)生溶血[15-16]。由于高氮無鎳不銹鋼是一種惰性金屬材料，因此在體液環(huán)境中溶出的毒性金屬離子量微少，對紅細胞的破壞微弱，不易發(fā)生溶血。此外，與L605和316L不銹鋼相比，由于屏蔽了有害鎳離子對溶血的促進作用，因此高氮無鎳不銹鋼顯示出更優(yōu)異的抗溶血性能[17]。

臨床研究表明[18-20]，支架在植入人體后，對血管壁造成的損傷、炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致血管平滑肌細胞的過度增殖以及血栓形成，從而引起血管支架內(nèi)再狹窄。Koster等[21]研究了鎳、鉻和鉬等金屬離子釋放引起的過敏反應(yīng)與支架內(nèi)再狹窄之間的關(guān)系，認(rèn)為金屬離子（特別是Ni）引起的接觸過敏加重了炎癥反應(yīng)，刺激了支架周圍新生組織的增生，從而增加了支架內(nèi)再狹窄的可能性。另有研究認(rèn)為鎳是慢性難治性支架內(nèi)再狹窄的主要原因之一[22-24]。因此，研究支架材料對平滑肌細胞增殖的影響起著至關(guān)重要的作用。有研究證明[25]，HNNFS表面培養(yǎng)的HUASMC的凋亡比率高于316LSS，通過Real-time PCR檢測細胞凋亡基因，提示HNNFS可能通過外源性和內(nèi)源性兩種途徑全面介導(dǎo)HUASMC的凋亡，從而抑制平滑肌細胞的增殖。

本文通過細胞增殖率、細胞黏附實驗，對比研究了3種實驗材料對人臍動脈平滑肌細胞增殖情況的影響，實驗數(shù)據(jù)表明，與L605和316L SS相比，HNNFS對于平滑肌細胞具有顯著的抑制作用。這一觀察結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。本研究的實驗結(jié)果和結(jié)論尚處于初級階段，支架內(nèi)再狹窄是一個非常復(fù)雜的過程，高氮無鎳不銹鋼材料對支架內(nèi)再狹窄影響的機理需要進一步研究。

4 結(jié)論與展望

目前，包括中國的很多國家已經(jīng)下調(diào)了醫(yī)用不銹鋼中Ni的標(biāo)準(zhǔn)含量，并發(fā)布了醫(yī)用無鎳不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)。高氮無鎳不銹鋼作為一種新型的生物醫(yī)用材料，由于其不含Ni元素，且具有優(yōu)異的綜合性能，在多個領(lǐng)域中已經(jīng)取得重要進展。作為冠脈支架植入材料，高氮無鎳不銹鋼具有良好的血液相容性，同時對血管平滑肌細胞的增殖具有一定的抑制作用，對降低支架植入后引起的再狹窄具有十分重要的意義。

相較傳統(tǒng)不銹鋼，無鎳不銹鋼具有更優(yōu)異的物理性能、化學(xué)性能及生物相容性，近些年仍會是醫(yī)用金屬材料的研究熱點。隨著對無鎳不銹鋼的生物安全性和力學(xué)性能等相關(guān)基礎(chǔ)性研究的不斷深入進行及逐步優(yōu)化，醫(yī)用高氮無鎳不銹鋼將會逐漸取代傳統(tǒng)醫(yī)用不銹鋼，推動具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型醫(yī)用不銹鋼的臨床應(yīng)用。

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