張 莎 魏純純 任安經(jīng) 章衛(wèi)平 吳 弘

(海軍軍醫(yī)大學(xué),1 附屬長(zhǎng)海醫(yī)院心內(nèi)科; 2 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,上海 200433)

隨著介入器械的發(fā)展,經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)逐年增加,而PCI術(shù)后管腔再狹窄是其最常見的并發(fā)癥之一。雖然藥物洗脫支架及藥物球囊被廣泛應(yīng)用,但再狹窄率仍接近10%,對(duì)于復(fù)雜病變,再狹窄率依病變復(fù)雜程度及患者的易感性進(jìn)一步升高[1]。同時(shí),藥物非選擇性的抗增殖作用抑制血管的再內(nèi)皮化,導(dǎo)致支架內(nèi)血栓形成的發(fā)生率升高[2]。近些年研發(fā)的生物可降解支架理論上可部分解決上述問題,因此,在動(dòng)物模型上重建血管成型術(shù)后內(nèi)膜增生的病理過程對(duì)于探究再狹窄的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及治療策略尤為重要。目前國(guó)際上比較公認(rèn)的小鼠血管內(nèi)膜增生模型,根據(jù)損傷的部位不同,分為股總動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈;根據(jù)損傷方式的不同,可分為結(jié)扎和導(dǎo)絲損傷。因此可以衍生出4種不同的術(shù)式：股動(dòng)脈結(jié)扎[3]、股動(dòng)脈導(dǎo)絲損傷[4]、頸總動(dòng)脈結(jié)扎[5]和頸總動(dòng)脈導(dǎo)絲損傷[6]。以往研究顯示：右側(cè)頸總動(dòng)脈管徑更接近于冠狀動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu),且在頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后14d,管腔出現(xiàn)明顯的新生內(nèi)膜[5];在頸總動(dòng)脈導(dǎo)絲損傷術(shù)后14d,管腔的再內(nèi)皮化程度達(dá)80%,亦形成明顯的新生內(nèi)膜[7]。因此,本研究選擇右側(cè)頸總動(dòng)脈為手術(shù)側(cè),以血管損傷術(shù)后14d為觀察終點(diǎn),探究小鼠頸總動(dòng)脈結(jié)扎及導(dǎo)絲損傷模型的異同及優(yōu)缺點(diǎn),進(jìn)一步指導(dǎo)血管內(nèi)膜增生模型的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物喂養(yǎng)與分組

13只10周齡左右,體質(zhì)量為23～28g,清潔級(jí),雄性C57BL/6小鼠(海軍軍醫(yī)大學(xué)病理生理教研室動(dòng)物所提供)。術(shù)前飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi),手術(shù)于屏障內(nèi)手術(shù)間進(jìn)行,術(shù)后仍飼養(yǎng)于屏障內(nèi)。將13只小鼠隨機(jī)分為3組：第1組5只,行頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù),右側(cè)為手術(shù)側(cè),左側(cè)為陰性對(duì)照側(cè);第2組5只,行頸總動(dòng)脈導(dǎo)絲損傷術(shù),右側(cè)為手術(shù)側(cè),左側(cè)為陰性對(duì)照側(cè);第3組3只,左右兩側(cè)均為正常對(duì)照側(cè)。

1.2 主要試劑

蘇木素粉劑(BBI Life Sciences);伊紅粉劑(上海生工公司); SM22抗體(Bioss公司); Goat-anti-rabbit IgG (Vector Laboratories公司);Fluorescence systems tyramide signal amplification (FITC) (Life Sciences公司);anti-Fluorecein-Alexa Fluor 488 conjugate及DAPI (Molecular Probes公司)。

1.3 頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型的制備

按0.4mg/kg的劑量腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠,5min后,用眼科鑷夾尾巴,小鼠反應(yīng)消失,視為麻醉充分。將小鼠以仰臥位固定于解剖板上,使小鼠軀干垂直于術(shù)者,頭部位于術(shù)者遠(yuǎn)端。先固定下肢,再固定頭部,最后固定上肢,以確保小鼠軀干處于直立位置,有利于手術(shù)視野的暴露。用脫毛膏脫去小鼠頸部毛發(fā),常規(guī)消毒。取頸部正中切口,長(zhǎng)約1cm。沿氣管右緣進(jìn)行鈍性分離,暴露右頸總動(dòng)脈,用彎顯微鑷盡可能多地向遠(yuǎn)心端游離頸總動(dòng)脈,直至暴露頸總動(dòng)脈分杈,將與之伴行的迷走神經(jīng)完全分離,在頸總動(dòng)脈近分杈處用5.0的絲線結(jié)扎血管,阻斷血流。生理鹽水沖洗手術(shù)區(qū),縫合切口,消毒皮膚。將小鼠置于37℃暖墊上,待麻醉清醒后置于干凈籠內(nèi),自由進(jìn)食、飲水,每天觀察小鼠的生命體征。

1.4 頸總動(dòng)脈導(dǎo)絲損傷模型的制備

麻醉、固定、脫毛過程同結(jié)扎模型,頸部正中切口長(zhǎng)約1.5cm。分離頸總動(dòng)脈,在近心端置一根5.0絲線備用。向頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端繼續(xù)鈍性分離,可見頸總動(dòng)脈分杈。首先,盡可能多的游離頸外動(dòng)脈,近端、遠(yuǎn)端分別置線;然后,將解剖板順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°,繼續(xù)游離頸內(nèi)動(dòng)脈,游離長(zhǎng)度無要求,注意勿損傷與之伴行的迷走神經(jīng),在近心端置線。將解剖板繼續(xù)順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°,先結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端,預(yù)結(jié)扎近心端;隨后,牽拉頸內(nèi)動(dòng)脈絲線阻斷血流;最后,牽拉頸總動(dòng)脈絲線阻斷血流,從而使頸外動(dòng)脈處于充盈狀態(tài)。在頸外動(dòng)脈結(jié)扎處與頸總動(dòng)脈分杈之間,用顯微剪與血管呈45°剪開一V型切口,以切口底邊占頸外動(dòng)脈血管周長(zhǎng)的1/3至1/2為宜。用自制鉤針勾住V型瓣,向上提拉,用顯微鑷夾持直徑為0.38mm的金屬導(dǎo)絲,插入血管腔,導(dǎo)絲進(jìn)入長(zhǎng)度8mm,在10s時(shí)間內(nèi)緩慢來回抽動(dòng)5次,以造成內(nèi)膜剝離。在撤出導(dǎo)絲的同時(shí),牽拉頸總動(dòng)脈絲線阻斷血流,防止出血。結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端。余步驟同頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型。

1.5 取材

術(shù)后14d行頸總動(dòng)脈超聲檢查,隨后處死,取材。麻醉、固定、切開操作同手術(shù)過程。鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,每根血管下各置2根5.0的絲線,供提拉血管用。剪開胸腔,暴露心,剪開右心房,從心尖插入灌注針,后接10ml注射器,1min左右注入約10ml的灌注用PBS,沖洗血管腔內(nèi)的血流。隨后在3min左右的時(shí)間緩慢注入約20ml的預(yù)冷的4%多聚甲醛,初步固定血管形態(tài)。先取損傷側(cè)血管,提拉預(yù)留的絲線,用顯微剪剪開頸總動(dòng)脈近心端,此處剪取盡可能長(zhǎng)的頸總動(dòng)脈。用顯微鑷夾住血管近心端,提拉預(yù)留的絲線,在頸總動(dòng)脈分杈處剪斷血管(結(jié)扎側(cè)緊貼結(jié)扎線結(jié)的近心端剪斷血管),術(shù)者要銘記血管方向,切勿弄反。將取下的血管浸入盛有4%多聚甲醛的60mm的培養(yǎng)皿,在解剖顯微鏡下,分離血管外膜,對(duì)血管近心端進(jìn)行修剪,預(yù)留血管長(zhǎng)度約2mm。將血管置于擦鏡紙上,并用鉛筆畫圈標(biāo)記血管位置,畫箭頭標(biāo)記血管方向。用擦鏡紙包裹血管于包埋框,置于4%多聚甲醛中,4°搖床固定2h,常規(guī)制備蠟塊。注意包埋時(shí),頸總動(dòng)脈近心端朝下直立包埋血管。

1.6 切片與貼片

從切到血管開始,每20片為1組,每片厚度為4μm,按順序排放在白紙板上,直至血管被切完,共計(jì)15～20片組織切片。由于血管較小,可在顯微鏡下觀察以確定蠟片上是否存在血管。從最后1組開始,從后往前(即從頸總動(dòng)脈分杈處向近心端)在攤片機(jī)水槽內(nèi)進(jìn)行撈片,每組取1片,共計(jì)取10組(即遠(yuǎn)離分杈處的血管棄用),于同1張玻片上,按順序從A-J編號(hào),此之為1套,共計(jì)取10套,并按順序從110標(biāo)號(hào)。結(jié)扎側(cè)與非結(jié)扎側(cè)處理方法相同。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,均取相同標(biāo)號(hào)相同編號(hào)的組織進(jìn)行比較,以盡可能的做到比較部位的一致性。

1.7 形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法

利用上述組織切片,行H-E染色評(píng)價(jià)頸總動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)。免疫熒光SM22染色：一抗SM22(1∶300),二抗Goat-anti-rabbit IgG(1∶300),放大液FITC (1∶50),anti-FITC-Alexa Fluor 488(1∶300),陽(yáng)性表達(dá)為綠色熒光,用DAPI染細(xì)胞核。在熒光顯微鏡成像系統(tǒng)(BX53,Olympus)下拍照,用ipwin326軟件進(jìn)行圖像分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血流速度分析

正常情況下,雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流速度無明顯差異。結(jié)扎術(shù)后14d,結(jié)扎側(cè)無明顯血流信號(hào),對(duì)側(cè)血流代償性增快。與正常對(duì)照的左側(cè)頸總動(dòng)脈相比,非結(jié)扎側(cè)血管最大收縮期流速(systolic velocity peak,SVP)、舒張末期流速(end-diastolic velocity,EDV)均加快,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而阻力指數(shù)(resistance index,RI)無明顯差異。導(dǎo)絲損傷術(shù)后14d,導(dǎo)絲損傷側(cè)SVP均較對(duì)側(cè)增快(P<0.05),EDV較對(duì)側(cè)降低(P<0.05),RI較對(duì)側(cè)升高(P<0.01),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常對(duì)照的頸總動(dòng)脈相比,導(dǎo)絲損傷側(cè)及其對(duì)側(cè)血流均增快(P<0.01),導(dǎo)絲損傷側(cè)阻力指數(shù)升高(P<0.01),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與非結(jié)扎側(cè)相比,非導(dǎo)絲損傷側(cè)血管血流速度及阻力指數(shù)均無顯著差異(表1,圖1)。

**P<0.01vsnormal (left) group;△△P<0.01vsnormal (right) group;##P<0.01vsnon-ligation side group;□P<0.05,□□P<0.01vsnon-wire injury side

圖1 術(shù)后14d頸總動(dòng)脈超聲檢測(cè)血流變化Fig 1 The blood flow velocity of common carotid artery 14d after operation

2.2 新生內(nèi)膜的形成

對(duì)于正常的血管,內(nèi)膜層由單層扁平上皮及內(nèi)膜下基質(zhì)構(gòu)成,H-E染色下內(nèi)膜層不可見,面積近似為0μm2。非手術(shù)側(cè)血管壁光滑,可見中膜層排列有致的彈性纖維板;而結(jié)扎側(cè)及導(dǎo)絲損傷側(cè)中膜層細(xì)胞核增大,中膜增厚,伴新生內(nèi)膜形成。內(nèi)膜中細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞核較中膜層小,無彈性纖維板。與導(dǎo)絲損傷側(cè)相比,結(jié)扎側(cè)新生內(nèi)膜面積(P<0.01)、中膜面積(P<0.05)及內(nèi)中膜比(P<0.01)均明顯大于導(dǎo)絲損傷側(cè),且兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2,圖2)。與正常對(duì)照的左側(cè)頸總動(dòng)脈相比,非結(jié)扎側(cè)及非導(dǎo)絲損傷側(cè)血管形態(tài)無顯著差異。

2.3 平滑肌細(xì)胞去分化程度

平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)志分子SM22染色結(jié)果表明：術(shù)后14d,非結(jié)扎側(cè)及非導(dǎo)絲損傷側(cè)血管中膜層全層均勻一致高表達(dá)SM22;但手術(shù)側(cè)中膜層SM22的表達(dá)量明顯降低,以新生內(nèi)膜處降低最為顯著,且結(jié)扎側(cè)血管SM22表達(dá)量低于導(dǎo)絲損傷側(cè),提示與導(dǎo)絲損傷相比,結(jié)扎血管使平滑肌細(xì)胞由分化型轉(zhuǎn)變?yōu)槿シ只偷某潭雀用黠@(圖3)。與正常對(duì)照的左側(cè)頸總動(dòng)脈相比,非結(jié)扎側(cè)及非導(dǎo)絲損傷側(cè)血管SM22表達(dá)量無顯著差異。

表2 術(shù)后14d各組的血管形態(tài)學(xué)指標(biāo)Tab 2 Morphological analysis 14d after operation (n=5,

*P<0.05 ,**P<0.01vsligation side

3 討論

3.1 關(guān)于兩組模型操作的主要體會(huì)

本研究結(jié)果表明頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型操作簡(jiǎn)單,術(shù)者稍加練習(xí)即可得到穩(wěn)定的結(jié)果。而導(dǎo)絲損傷模型操作復(fù)雜,技術(shù)難點(diǎn)較多,如：熟練的分離3根頸總動(dòng)脈、V形切口深度的把握、導(dǎo)絲的進(jìn)入、導(dǎo)絲的抽動(dòng)等等,需花費(fèi)大量時(shí)間一一攻克。最終即使上述步驟均熟練掌握,還會(huì)因小鼠血管結(jié)構(gòu)的個(gè)體差異而出現(xiàn)內(nèi)膜增生程度的不穩(wěn)定。導(dǎo)絲成功進(jìn)入血管后,術(shù)者感受到的阻力,大體上可分為以下3種情況：(1) 導(dǎo)絲進(jìn)出通暢,不感阻力,可能是由于導(dǎo)絲相對(duì)血管細(xì),不能有效損傷血管內(nèi)皮,模型失敗;(2) 導(dǎo)絲進(jìn)出通暢,全程可感均勻一致的摩擦阻力,提示導(dǎo)絲與血管貼合良好,可導(dǎo)致血管壁的有效損傷;(3) 導(dǎo)絲進(jìn)出困難,可感明顯摩擦阻力,在導(dǎo)絲前端有時(shí)可看到白色絮狀團(tuán)塊?？赡苁怯捎趯?dǎo)絲相對(duì)血管粗,不僅損傷血管內(nèi)皮層,甚至觸及淺層的平滑肌層,易導(dǎo)致血管夾層,甚至血管破裂。通常將第2種情況的小鼠納入實(shí)驗(yàn),進(jìn)而可提高頸總動(dòng)脈導(dǎo)絲損傷模型結(jié)果的穩(wěn)定性。

圖2 術(shù)后14d頸總動(dòng)脈H-E染色,×200.
圖3 術(shù)后14d頸總動(dòng)脈SM22染色,×200.
Fig 2 H-E staining of common carotid artery 14d after operation,×200.
Fig 3 SM22 staining of common carotid artery 14d after operation,×200.

3.2 關(guān)于2組模型內(nèi)膜增生機(jī)制的探討

上述2種內(nèi)膜增生模型其血管新生內(nèi)膜形成的機(jī)制各不相同,但中膜層的平滑肌細(xì)胞均被不同程度的激活,由分化型轉(zhuǎn)變?yōu)槿シ只?合成并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)其增殖、遷移,進(jìn)而形成新生內(nèi)膜。血管結(jié)扎模型通過阻斷血流引起結(jié)扎側(cè)頸總動(dòng)脈內(nèi)剪切力改變,血管壁搏動(dòng)及所受壓力增強(qiáng),觸發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞分泌白細(xì)胞黏附分子、趨化因子等,導(dǎo)致炎癥微環(huán)境,進(jìn)而激活平滑肌細(xì)胞[8]。而導(dǎo)絲損傷模型是通過完全剝脫血管內(nèi)皮細(xì)胞,一方面使鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以修復(fù)內(nèi)皮層;另一方面,中膜層的平滑肌細(xì)胞直接暴露于血流中被激活[9],術(shù)后28d時(shí)血管腔的再內(nèi)皮化基本完成,此時(shí)平滑肌細(xì)胞的增殖即終止[7]。與頸總動(dòng)脈導(dǎo)絲損傷模型相比,頸總動(dòng)脈結(jié)扎后新生內(nèi)膜、中膜增厚較顯著,內(nèi)中膜比及血管平滑肌細(xì)胞的去分化程度更高。

3.3 關(guān)于2組模型各自的適應(yīng)癥

就其病理意義而言,導(dǎo)絲損傷模型主要用于探究機(jī)械損傷內(nèi)皮細(xì)胞后對(duì)平滑肌細(xì)胞功能的影響,可用于模擬PCI術(shù)后早期管腔再狹窄的病理生理過程[10]。頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型主要用于探究血流剪切力的改變對(duì)平滑肌細(xì)胞功能的影響,可用于模擬PCI術(shù)后晚期(管腔再內(nèi)皮化已完成后)管腔再狹窄的病理生理過程[5]。

3.4 其他

近些年,越來越多的研究者開始關(guān)注股動(dòng)脈的導(dǎo)絲損傷[3,11]。在組織學(xué)上,頸總動(dòng)脈屬于大動(dòng)脈,而股動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈同屬于中動(dòng)脈,因此,在模擬冠狀動(dòng)脈血管增殖性疾病方面,股動(dòng)脈比頸總動(dòng)脈可能更契合相關(guān)病理過程。但由于小鼠股動(dòng)脈管徑太細(xì),手術(shù)難度進(jìn)一步增加,對(duì)術(shù)者及手術(shù)器械的要求更高,穩(wěn)定性更差,而且會(huì)不同程度的影響小鼠術(shù)肢的功能。目前,尚未得到廣泛的使用。

參 考 文 獻(xiàn)

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