葉海斌 樊英 李天保 李樂 王曉璐

摘要 在參考國內(nèi)外刺參免疫防御機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，綜述了刺參免疫防御系統(tǒng)的相關(guān)特征，以期通過各種免疫調(diào)節(jié)手段達(dá)到防病、治病的效果，促進(jìn)刺參養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

關(guān)鍵詞 刺參；免疫；防御機(jī)制；評價體系

中圖分類號 S947.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2018）16-0027-03

Abstract The paper summarized some characters of immunity about Apostichopus japonicus on the basis of researches on immunity defense mechanism of Apostichopus japonicus at home and abroad， and we could study a variety of immune means to improve the disease resistance effect， so promote the development of healthy aquaculture in Apostichopus japonicus.

Key words Apostichopus japonicus；Immunity；Defense mechanism；Evaluation system

海參綱屬棘皮動物門，種類甚多，全世界約1 200種，其中我國約140種，可食用海參20多種，其中10種具有較高的經(jīng)濟(jì)價值[1-3]。根據(jù)海參背面是否有圓錐肉刺狀的疣足分為“刺參類”和“光參類”兩大類，其中刺參類主要是刺參科種類，刺參科包括仿刺參、梅花參、綠刺參和花刺參，人們俗稱中的刺參即是仿刺參，或稱灰刺參、灰參，其品質(zhì)最佳。隨著人們生活水平和保健意識的提高，刺參的營養(yǎng)價值和保健作用越來越受到重視和應(yīng)用。近年來，刺參需求量的日益增加引發(fā)了各種各樣的問題[4-5]。海參的過度捕撈致使海洋種群數(shù)量日趨減少，自然資源面臨枯竭；海參養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模擴(kuò)大化、方式多樣化的熱潮致使養(yǎng)殖環(huán)境承受力下降，養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的病害狀況越來越重；不同來源的污染和藥物的濫用致使海參種苗質(zhì)量下降，食用安全質(zhì)量受到威脅，進(jìn)一步加劇了市場應(yīng)求和資源供求之間的矛盾，成為海參養(yǎng)殖業(yè)健康快速發(fā)展的障礙。故通過提高刺參自身的免疫能力達(dá)到防病治病的效果是海參健康養(yǎng)殖和高效生產(chǎn)最有效的根本解決辦法，對刺參免疫防御系統(tǒng)的研究迫在眉睫。

在自身免疫防御系統(tǒng)中非特異性免疫起主要作用，各式各樣的體腔細(xì)胞構(gòu)成刺參的細(xì)胞免疫系統(tǒng)，體腔液中的多種免疫因子則形成體液免疫系統(tǒng)，二者共同實行機(jī)體的免疫功能。其中，體液免疫是刺參防御病害入侵的主要免疫反應(yīng)，體腔液作為刺參最重要的免疫組織之一，具有抗菌特性[6]、酚氧化酶活性[7]等免疫學(xué)特性。了解海參的免疫系統(tǒng)有利于開展細(xì)胞和分子免疫水平的研究。筆者主要對刺參體腔液中的免疫系統(tǒng)進(jìn)行綜述，為刺參健康養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)，更為開發(fā)新型高效的免疫增強(qiáng)劑提供平臺。

1 體腔細(xì)胞

刺參體腔液中包含各種體腔細(xì)胞，分類多樣化，無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。Eliseikina等[8]將刺參體腔細(xì)胞分為祖細(xì)胞、變形細(xì)胞、空泡細(xì)胞、小桑葚細(xì)胞、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型的桑葚細(xì)胞、結(jié)晶細(xì)胞、顫動細(xì)胞；廖玉麟[9]將海參綱體腔細(xì)胞分為淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、無色桑葚細(xì)胞、血細(xì)胞、紡錘細(xì)胞和結(jié)晶細(xì)胞，指出并非所有海參都存在這6種細(xì)胞。劉曉云等[10]用電鏡技術(shù)將刺參體腔細(xì)胞分為大顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞、透明細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞。李華等[11]通過大量活體、滴片、光鏡和電鏡觀察，將仿刺參體腔細(xì)胞分為6類：淋巴樣細(xì)胞、球形細(xì)胞、變形細(xì)胞、紡錘細(xì)胞、透明細(xì)胞、結(jié)晶細(xì)胞，球形細(xì)胞又分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型球形細(xì)胞；體腔中還存在血細(xì)胞，血細(xì)胞數(shù)量（Total haemocyte counts，THC）是重要的生理狀態(tài)指標(biāo)，與機(jī)體免疫力相關(guān)。從免疫機(jī)制角度而言，當(dāng)其受外界環(huán)境變化刺激或病原體感染后體腔細(xì)胞即開始活躍起來，通過多種途徑起到免疫防護(hù)的作用。

對于缺乏特異性免疫系統(tǒng)的刺參而言，細(xì)胞的吞噬作用是內(nèi)部免疫的第一道防線，是棘皮動物抵抗異物入侵最基本的細(xì)胞防御機(jī)制。刺參小淋巴細(xì)胞可分化成吞噬細(xì)胞和桑葚細(xì)胞，可通過各種方式形成吞噬細(xì)胞，伸出的較多偽足可凝集成塊，發(fā)揮吞噬功能[12]。邱芳蕾等[13]研究淡水底棲硅藻對刺參的效果試驗時以細(xì)胞吞噬率作為檢測指標(biāo)，很好地驗證了細(xì)胞免疫功能的提升。吞噬相關(guān)技術(shù)日漸成熟，針對刺參的免疫增強(qiáng)劑效果試驗中細(xì)胞吞噬率可作為反映機(jī)體免疫狀況的重要指標(biāo)。細(xì)胞吞噬活性指數(shù)同樣可衡量刺參體腔細(xì)胞的吞噬能力，葉海斌等[14]利用該項指標(biāo)研究了溶藻膠弧菌脂多糖對大菱鲆白細(xì)胞吞噬活性的影響，為細(xì)胞非特異性免疫研究提供了理論依據(jù)。在無脊椎動物中也存在一種類似于脊椎動物調(diào)理素樣物質(zhì)，在吞噬細(xì)胞和外源物之間起到識別和黏附的作用，促進(jìn)異物結(jié)合到吞噬細(xì)胞膜的受體上，增強(qiáng)吞噬作用，間接地加強(qiáng)了機(jī)體的免疫力。麥康森等[15]通過凝膠過濾層析和質(zhì)譜分析等方法分離鑒定出一種具有凝集特性的刺參調(diào)理素樣分子，增強(qiáng)該物質(zhì)的結(jié)合作用仍在深入研究中。

2 呼吸爆發(fā)及活性氧殺菌體系

體腔細(xì)胞吞噬異物，呼吸暴發(fā)產(chǎn)生大量的活性氧（O2-、OH、O2和H2O2），具有廣泛的殺菌作用，破壞細(xì)菌毒素、乙肝表面抗原等。近年來，活性氧體系作為機(jī)體免疫狀況的重要指標(biāo)研究已確立，張峰等[16]最先對無脊椎動物血細(xì)胞吞噬過程中產(chǎn)生的活性氧進(jìn)行了研究，流式細(xì)胞術(shù)對酵母誘導(dǎo)海參的吞噬作用中產(chǎn)生的活性氧可進(jìn)行定量測定。棘皮動物免疫防御機(jī)制中的活性氧研究相對薄弱，國內(nèi)尚未見關(guān)于刺參的深入研究。目前應(yīng)用檢測的技術(shù)包括細(xì)胞色素C還原法、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）檢測法、比色法及化學(xué)發(fā)光法?；钚匝醯膹?qiáng)弱直接反映血細(xì)胞的殺菌機(jī)能，可作為細(xì)胞免疫力的檢測指標(biāo)[17]。

3 一氧化氮?dú)⒕w系

一氧化氮?dú)⒕鷻C(jī)制有2種：一是作用于微生物的關(guān)鍵代謝酶，抑制代謝酶的活性或使其失活而發(fā)揮殺菌作用；另一種是通過和氧自由基作用生成強(qiáng)氧化劑，從而起到殺菌作用。截至目前，有關(guān)一氧化氮體系的研究已經(jīng)進(jìn)入了全新階段，在對蝦免疫學(xué)研究中的地位和作用已有相關(guān)報道，并綜合闡述了一氧化氮合成酶系統(tǒng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防御中的作用。姜國建等[18]研究表明，WSSV感染中國明對蝦能夠顯著誘導(dǎo)其血細(xì)胞一氧化氮合成酶NOS的表達(dá)。隨著WSSV在中國明對蝦體內(nèi)的增殖及對血細(xì)胞的破壞，使得NOS活性顯著降低，對蝦也趨于死亡，故認(rèn)為NOS活性能夠作為反映對蝦健康狀況的有效指標(biāo)，且進(jìn)一步利用硝基藍(lán)四唑（NBT）還原法和血細(xì)胞形態(tài)法對NOS進(jìn)行了鑒定。通過NO非特異性免疫功能的研究，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)NOS的表達(dá)來改變NO在水產(chǎn)動物體內(nèi)的含量，從而增強(qiáng)水產(chǎn)動物自身抗病能力，減少抗菌藥物的使用，對提高水產(chǎn)動物的免疫力和水產(chǎn)品的品質(zhì)具有重要作用。應(yīng)用于該體系鑒定的方法還有DAF-2法，基于抗原與抗體反應(yīng)的多克隆抗體法，以及采用組織化學(xué)和免疫組化技術(shù)進(jìn)行定位研究等。鑒于其他水產(chǎn)動物的應(yīng)用，該項檢測指標(biāo)亦可應(yīng)用于刺參免疫研究。

4 活性酶

研究表明，水產(chǎn)動物血細(xì)胞及體液中含有大量與免疫防御功能相關(guān)的酶類（如溶菌酶、磷酸酶、過氧化物酶、脂酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶等），外來病原體在刺參體內(nèi)的消除降解過程即視為酶解過程，通過內(nèi)外調(diào)節(jié)手段改變動物體內(nèi)酶水平可間接影響機(jī)體免疫能力。溶菌酶水平和活性已成為免疫學(xué)研究中重要的反映指標(biāo)。當(dāng)外界物質(zhì)刺激吞噬細(xì)胞，溶菌酶基因復(fù)制作用于微生物細(xì)胞壁，形成水解酶體系，從而破壞和消除入侵異物，達(dá)到防御和殺菌的作用。研究證實，黃芪能夠增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)超氧化物歧化酶活性，減少脂質(zhì)過氧化物生成，加強(qiáng)機(jī)體的抗病能力。目前，各種活性酶的檢測方法較多，在不同水產(chǎn)動物中應(yīng)用廣泛，針對刺參的相關(guān)免疫研究也很多[19-22]，均不同程度地反映了活性酶的免疫促進(jìn)作用。

5 凝集素和溶血素

凝集素也是血淋巴的常見成分。凝集素作為軟體動物體內(nèi)參與體液免疫的非特異免疫因子，在免疫防御活動中發(fā)揮對異體成分的識別、調(diào)理和促進(jìn)吞噬等重要作用。在機(jī)體受到外界某免疫刺激后，凝集效價明顯升高。從防病治病角度而言，凝集素效價也是反映免疫體系的重要指標(biāo)之一。故凝集素在海參免疫研究方面具有廣闊的前景，是防病治病的有效途徑。

作為一種糖結(jié)合蛋白，凝集素最大的特點是能識別糖蛋白和糖脂，特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，凝集變異細(xì)胞，防御病原體入侵。棘皮動物體內(nèi)同樣存在凝集素，在海參Stichopus japonicus中發(fā)現(xiàn)了2種不同的鈣離子依賴型（C型）凝集素。Jans等[12]從海參體腔液中分離出一種由體腔細(xì)胞釋放的分子量220 kD的凝集素，這種凝集素能提高體腔細(xì)胞黏附性并促進(jìn)體腔細(xì)胞向外來物質(zhì)聚集，起到保護(hù)機(jī)體的作用。李丹彤等[23]從刺參中分離純化得到凝集素并對其性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，凝集素可有效去除外來異物，但作為御敵的有力武器有待進(jìn)一步探究。

6 類補(bǔ)體樣物質(zhì)

補(bǔ)體系統(tǒng)是機(jī)體免疫防御機(jī)制的重要組成部分，在整個免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。研究表明，棘皮動物體內(nèi)可能存在補(bǔ)體旁路免疫機(jī)制，目前此類研究較少。張峰等[24-25]利用酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)能夠檢測到仿刺參體腔液中含有補(bǔ)體類似物，其中C3含量為（6.58±1.40）μg/mL，C4含量為（0.67±0.30）μg/mL；同時，采用3種補(bǔ)體檢測方法首次對仿刺參體內(nèi)補(bǔ)體類似物進(jìn)行檢測，并對補(bǔ)體類似物AjC3和AjC4進(jìn)行了活性探究。結(jié)果顯示，仿刺參體腔液、體腔液上清及體腔細(xì)胞中的補(bǔ)體溶血活性與正常人補(bǔ)體溶血活性相差很小，且接近于人體血清正常值（50～100 U/mL），健康仿刺參體內(nèi)含有很高的補(bǔ)體活性，具有類似于高等動物補(bǔ)體系統(tǒng)的免疫機(jī)制，為研究其病害發(fā)生過程中體內(nèi)的免疫機(jī)理提供了理論依據(jù)。補(bǔ)體含量及補(bǔ)體溶血活性作為刺參免疫功能的評價指標(biāo)已得到驗證；補(bǔ)體系統(tǒng)的存在及活性研究在棘皮動物海膽中也被證實。

7 細(xì)胞因子

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了更多的免疫相關(guān)基因。翟鈺等[26]篩選出刺參補(bǔ)體AjC3 活性相關(guān)miRNA；汪婷婷[27]對刺參NF-κB信號通路中的Aj-rel和Aj-pl05基因進(jìn)行了克隆鑒定，并進(jìn)行了蛋白表達(dá)以及功能研究。同時，C型凝集素[28]、鐵蛋白（ferritin）[29]等刺參免疫相關(guān)基因均有報道。在無脊椎動物中發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素是其體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)蛋白，同時承擔(dān)免疫防御機(jī)制中介質(zhì)的作用，此外還參與機(jī)體的多種生理及病理反應(yīng)。2015年7月16日，中國科學(xué)院海洋研究所宣布完成了刺參基因組測序和組裝工作，這一成果對刺參生物學(xué)和遺傳育種研究具有重要科學(xué)意義，為深化刺參免疫學(xué)基礎(chǔ)研究、揭示刺參免疫防御機(jī)理提供了技術(shù)支撐。

8 小結(jié)

目前，有關(guān)刺參免疫機(jī)制的研究在國內(nèi)外尚處于不成熟階段，需要進(jìn)一步探索。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，雖然對刺參的免疫研究取得了一定成果，但部分免疫機(jī)制研究不夠透徹，導(dǎo)致很多防御機(jī)制尚未知。另外，針對目前嚴(yán)重的病害狀況，更深入地了解刺參的免疫機(jī)制，是解決這一問題的關(guān)鍵，為防治病害和健康養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 姜金忠，劉富聰.海參的養(yǎng)殖及病害防治技術(shù)（上）[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2006（1）：77.

[2] 姜金忠，劉富聰.海參的養(yǎng)殖及病害防治技術(shù)（下）[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2006（2）：77.

[3] 孫永欣，王吉橋，汪婷婷，等.海參防御機(jī)制的研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)科學(xué)，2007，26（6）：358-361.

[4] 張春云，王印庚，榮小軍，等.國內(nèi)外海參自然資源、養(yǎng)殖狀況及存在問題[J].海洋水產(chǎn) 研究，2004，25（3）：89-97.

[5] 王印庚，榮小軍.我國刺參養(yǎng)殖存在的主要問題與疾病綜合防治技術(shù)要點[J].齊魯漁業(yè)， 2004，21（10）：29-32.

[6] 叢聰，蔣經(jīng)偉，董穎，等.仿刺參體腔液的抗菌特性[J].水產(chǎn)學(xué)報，2014，38（9）：1548-1556.

[7] 王軼南，穆曉虎，封妮莎，等.仿刺參體腔液中酚氧化酶活性的分析[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報，2013，28（4）：319-322.

[8] ELISEIKINA M G，MAGARLAMOV T Y.Coelomocyte morphology in the holothurians Apostichopus japonicus（Aspidochirota：Stichopodidae）and Cucumaria japonica（Dendrochirota：Cucumariidae）[J].Russian journal of marine biology，2002，28（3）：197-202.

[9] 廖玉麟.中國動物志：棘皮動物學(xué) 海參綱[M].北京：科學(xué)出版社，1997.

[10] 劉曉云，譚金山，包振民，等.刺參體腔細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察[J].電子顯微學(xué)報，2005，24（6）：613-615.

[11] 李華，陳靜，陸佳，等.仿刺參體腔細(xì)胞和血細(xì)胞類型及體腔細(xì)胞數(shù)量研究[J].水生生物學(xué)報，2009，33（2）：207-213.

[12] JANS D，DUBOIS P，JANGOUX M.Defensive mechanisms of holothuroids（Echinodermata）：Formation，role，and fate of intracoelomic brown bodies in the sea cucumber Holothuria tubulosa[J].Cell Tissue Res，1995，283（1）：99-106.

[13] 邱芳蕾，鄒寧，王海娜，等.淡水底棲硅藻對刺參的餌料效果[J].生命科學(xué)儀器，2017，5（10）：16-18.

[14] 葉海斌，朱安成，張濤，等.溶藻膠弧菌脂多糖對大菱鲆白細(xì)胞吞噬活性的影響[J].齊魯漁業(yè)，2006，23（3）：34-36.

[15] 麥康森，孟繁伊，馬洪明，等.在仿刺參體腔液中發(fā)現(xiàn)新的調(diào)理素樣分子[J].中國工程科學(xué)，2009，11（10）：108-114.

[16] 張峰，李光友，張培軍.皺紋盤鮑血細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的研究[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，1999，6（3）：36-40.

[17] SUN Y X，JIN L J，WANG T T，et al.Polysaccharides from Astragalus membranaceus promote phagocytosis and superoxide anion（O2-）production by coelomoeytes from sea cucumber Apostichopus japonicus in vitro[J].Comp Biochem Physiol Part C，2008，147（3）：293-298.

[18] 姜國建，于仁誠，王云峰，等.中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）血細(xì)胞中一氧化氮合成酶的鑒定及其在白斑綜合癥病毒感染過程中的變化[J].海洋與湖沼，2004，35（4）：342-350.

[19] 樊英，王淑嫻，葉海斌，等.黃芪多糖對仿刺參非特異性免疫功能的影響[J].水產(chǎn)科學(xué)， 2010，29（6）：321-324.

[20] 嚴(yán)芳，胡煒，李成林，等.飼料中添加活性酵母制劑對刺參生長、免疫力和抗病力的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2017，29（2）：583-589.

[21] 李繼業(yè).養(yǎng)殖刺參免疫學(xué)特征與病害研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2007.

[22] 憨素連，王福強(qiáng)，王晶，等.復(fù)合益生菌對刺參非特異性免疫和抗病力的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（36）：94-96，101.

[23] 李丹彤，宋亮，鐘莉，等.刺參凝集素的分離純化及其性質(zhì)[J].水產(chǎn)學(xué)報，2005，29（5）：654-658.

[24] 張峰，王海峰，宮晶，等.仿刺參體腔液補(bǔ)體類似物化學(xué)發(fā)光免疫檢測[J].核農(nóng)學(xué)報，2007，21（4）：413-416.

[25] 張峰，宮晶，王海峰，等.仿刺參補(bǔ)體類似物活性的測定[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報，2007，22（4）：246-248.

[26] 翟鈺，曹雁惠，張峰，等.刺參補(bǔ)體AjC3活性相關(guān)mRNA的篩選與初步研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報，2015，30（6）：585-591.

[27] 汪婷婷.剌參三種免疫基因的克隆、表達(dá)及功能研究[D].大連：大連理工大學(xué)，2012.

[28] 薛壯，李慧，孫鶴，等.刺參C型凝集素（AJL）基因的克隆及原核表達(dá)分析[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報，2015，30（6）：610-615.

[29] 楊愛馥，周遵春，孫大鵬，等.仿刺參鐵蛋白ferritin基因的序列分析及表達(dá)[J].水產(chǎn)學(xué)報，2010，34（6）：890-897.