范存靜 邱敬濤 張曉光 盧學峰

鄭州大學第二附屬醫(yī)院超聲科（鄭州 450014）

隨著人們物質(zhì)生活的改善，心、腦血管疾病的發(fā)生率越來越高，已經(jīng)成為中老年人的主要死亡原因之一［1-2］。大量研究［3］顯示，動脈粥樣硬化是心、腦血管疾病的獨立危險因素，斑塊破裂繼發(fā)血栓形成則直接導致了急性心肌梗塞、急性腦梗、缺血性腦卒中等疾病的發(fā)生［4］。有研究顯示，伐瑞拉地（Varespladib）具有減輕大鼠動脈粥樣硬化損害的作用，但對兔動脈粥樣硬化的作用未見報道。本研究首次觀察Varespladib對兔頸動脈粥樣硬化斑塊的作用，目的是為臨床開發(fā)新型降血脂藥物提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性大白兔20只，平均體重（2.4±0.5）kg，月齡2～3個月，購于鄭州大學實驗動物中心。

1.2 儀器與試劑采用帶UE功能的HITACHI Preirus彩色超聲儀，探頭頻率5～13 MHz。高敏C反應蛋白（hs?CRP）、腫瘤壞死因子?α（TNF?α）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL?C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL?C）檢測試劑盒均購自鄭州安塞生物科技有限公司；巨噬細胞CD68檢測試劑盒購自美國Sigma公司；球囊導管（直徑2.5 mm）購自深圳朗醫(yī)科技有限公司；全自動低溫離心機購自上海艾測電子科技有限公司。

1.3 分組及模型制備將20只大白兔用普通飼料喂養(yǎng)1周后，隨機將其分為實驗組和對照組，每組各10只。兩組均采用4F Forgaty球囊導管行頸動脈內(nèi)膜損傷術。術后對照組僅給予高脂飼料喂養(yǎng)（1%膽固醇、4%豬油、10%蛋黃粉和85%普通飼料）；試驗組給予高脂飼料的同時還給予Varesp?ladib（30 mg/kg）。

1.4 實驗方法兩組在第18周時均經(jīng)兔耳緣靜脈取血采用酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa試劑盒）檢測hs?CRP、TNF?α和血脂情況（TC、HDL?C、LDL?C），同時兩組均行頸動脈超聲檢查，運動彈性成像技術［5］對頸動脈斑塊進行評分，將其分為穩(wěn)定斑塊（彈性評分≥3分）和易損斑塊，即不穩(wěn)定斑塊（彈性評分＜3分）。取血后處死動物，分離頸總動脈，并進行固定、包埋、切片和HE染色。每組選取10個高倍鏡視野，運用免疫組織化學染色技術檢測巨噬細胞CD68的陽性細胞數(shù)表達情況。

1.5 統(tǒng)計學方法統(tǒng)計軟件應用SPSS 17.0，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示，定量資料采用非參數(shù)檢驗，定性資料采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組頸動脈斑塊的超聲檢查結果試驗組共檢出頸動脈斑塊69個，其中穩(wěn)定斑塊48個，易損斑塊21個；對照組共檢出頸動脈斑塊138個，其中穩(wěn)定斑塊35個，易損斑塊103個，兩組結果比較，差異有統(tǒng)計學意義。試驗組斑塊面積占管腔總面積的百分比為（25.07±7.31）%，對照組斑塊面積占管腔總面積的百分比為（39.24±9.52）%。兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。見表1、表2、圖1。

表1 兩組不同類型頸動脈斑塊數(shù)量的比較Tab.1 The number of the two different types of carotid artery plaques in the two groups 個（%）

圖1 頸總動脈斑塊的超聲彈性成像表現(xiàn)Fig.1 The elasticity imaging of the two types of carotid artery plaque

表2 兩組斑塊面積占管腔總面積的百分比Tab.2 The percentage of plaque area in total lumen area±s

表2 兩組斑塊面積占管腔總面積的百分比Tab.2 The percentage of plaque area in total lumen area±s

組別試驗組對照組Z值P值斑塊面積占管腔總面積的百分比（%）25.07±7.31 39.24±9.52 8.842 0.001

2.2 Varespladib對炎癥因子及血脂水平的影響試驗組與對照組血清炎癥因子比較，hs?CRP及TNF?α均降低，其中hs?CRP顯著降低且差異有統(tǒng)計學意義（Z=3.780，P＜ 0.001），而TNF?α僅輕度降低，差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.965，P=0.050）；試驗組與對照組血脂水平比較，TC、HDL?C及LDL?C均有所降低，其中LDL?C降低明顯且差異有統(tǒng)計學意義（Z=3.780，P＜0.001）；而TC和HDL?C僅輕度降低，差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.475，P=0.140；Z=1.361，P=0.173）。見表3。

表3 兩組炎癥因子及血脂水平的比較Tab.3 The level of inflammatory factors and blood lipids in the two groups ±s

表3 兩組炎癥因子及血脂水平的比較Tab.3 The level of inflammatory factors and blood lipids in the two groups ±s

組別試驗組對照組Z值P值hs?CRP（mg/L）5.56±0.41 16.34±0.44 3.780 0.001 TNF?α（mg/L）55.25±0.62 55.98±0.98 1.965 0.050 TC（mmol/L）15.19±0.99 15.91±0.64 1.475 0.140 HDL?C（mmol/L）0.91±0.14 1.05±0.24 1.361 0.173 LDL?C（mmol/L）5.42±0.62 15.71±0.60 3.780 0.001

2.3 正常頸動脈管壁、頸動脈穩(wěn)定斑塊及易損斑塊的病理表現(xiàn)圖2A為正常頸動脈管壁，管壁層次清晰，內(nèi)膜光滑平整；圖2B為穩(wěn)定斑塊，可見凸向管腔的連續(xù)性斑塊，內(nèi)膜中可見泡沫化巨噬細胞和平滑肌細胞；圖2C為易損斑塊，可見內(nèi)膜表面不光滑，不連續(xù)，并有血栓附著。

圖2 正常頸總動脈壁及不同頸動脈斑塊的病理表現(xiàn)（HE，×400）Fig.2 The pathology of normal carotid artery wall and the different types of carotid artery plaque（HE，× 400）

2.4 兩組頸動脈斑塊內(nèi)巨噬細胞CD68的表達情況對照組巨噬細胞CD68的陽性表達數(shù)為（73.50±5.32）個/HP，試驗組巨噬細胞CD68的陽性表達數(shù)為（45.30±4.52）個/HP，試驗組巨噬細胞CD68的陽性表達數(shù)明顯少于對照組（Z=3.785，P＜0.001）。見圖3。

圖3 兩組頸動脈斑塊內(nèi)巨噬細胞CD68的免疫組化結果（SP，×100）Fig.3 The immunohistochemical effects of CD68 on the macrophages in the two types of carotid artery plaque（SP，×100）

3 討論

動脈粥樣硬化是一種由多因素介導的累及全身多個系統(tǒng)、器官的疾病［6］，動脈粥樣硬化易損斑塊可以形成表面潰瘍、斑塊破裂并繼發(fā)血栓形成，導致急性心、腦血管疾?。?］。磷脂酶A2是一種鈣離子依賴性磷脂酶，被激活后可以促使LDL?C升高，產(chǎn)生大量生物活性物質(zhì)，并通過炎癥因子激活血管壁中的促動脈粥樣硬化通路，形成斑塊［8］。磷脂酶A2中只有可溶性磷脂酶A2能夠促進LDL?C的轉(zhuǎn)移，但幾乎所有的磷脂酶都能夠與LDL?C結合，形成動脈粥樣硬化微顆粒［8］。因此，抑制磷脂酶的功能對減輕動脈粥樣硬化的程度具有重要的作用。

Verespladib是一種新型的非選擇性磷脂酶A2抑制劑，其對磷脂酶的抑制范圍較廣。Verespladib與傳統(tǒng)的、以降脂為目的的他汀類藥物不同，傳統(tǒng)的他汀類藥物能降低LDL及hs?CRP水平，能夠直接或間接的抑制炎癥反應，但對磷脂酶的作用很小。Verespladib作為一種磷脂酶A2抑制劑能夠特異的與磷脂酶A2結合，抑制其活性，進而抑制由其介導的一系列炎癥反應。本研究結果顯示，試驗組中斑塊的檢出數(shù)量明顯少于對照組，且穩(wěn)定斑塊的數(shù)量明顯多于對照組，穩(wěn)定斑塊的彈性分值也高于易損斑塊，說明Verespladib具有顯著的抗動脈粥樣硬化，增強斑塊穩(wěn)定性的作用。這與HURT?CAMEJO等［9］在小鼠身上進行的研究結果基本一致。本研究中試驗組hs?CRP表達量、LDL?C的含量均顯著低于對照組，這與傳統(tǒng)的他汀類藥物的療效一致，Verespladib通過不同的途徑達到了同樣的效果。巨噬細胞在動脈粥樣硬化的進展中具有重要的作用，活化的巨噬細胞能夠吞噬LDL?C進而形成泡沫細胞，大量泡沫細胞聚集在斑塊的纖維帽中，加上其他脂質(zhì)和細胞使纖維帽的張力增加，厚度變薄，穩(wěn)定性變?nèi)?，容易破裂?0-11］。本研究通過免疫組化技術檢測巨噬細胞表面的特異性抗原CD68，結果顯示，試驗組中巨噬細胞CD68的陽性表達量明顯少于對照組，而且試驗組中斑塊面積占管腔總面積的百分比明顯低于對照組，這說明Verespladib可以通過減少動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞的數(shù)量來減小斑塊的面積，抑制斑塊的進展，從而增加斑塊的穩(wěn)定性［12-13］。

綜上所述，Verespladib在抗動脈粥樣硬化及增加易損斑塊穩(wěn)定性的過程中具有重要的作用，雖然國外有研究［14-16］發(fā)現(xiàn)Verespladib能增加心血管事件的發(fā)生率，但基于其顯著的降血脂作用，還需對其進行更深一步的研究，或者考慮聯(lián)合用藥，通過動物實驗和大規(guī)模臨床試驗來驗證其療效。

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