李敏英 李文 陶愛林

廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣東省過敏反應與免疫重點實驗室/呼吸疾病國家重點實驗室（廣州510260）

抗原提呈細胞（antigen?presenting cell，APC）攝取抗原并將其處理成免疫原性多肽，以抗原肽?MHC分子復合物的形式表達于APC表面，供T細胞表面（T cell receptor，TCR）識別［1］，CD4+T細胞通過識別MHCⅡ?肽復合物而被激活，調節(jié)或者協(xié)助細胞免疫及體液免疫，在免疫應答中起非常重要的作用，檢測抗原特異性CD4+T細胞的傳統(tǒng)手段有酶聯(lián)免疫斑點法（ELISPOT）和有限稀釋法（LDA）等，但靈敏度較低。1996年，ALTMAN等［2］建立MHC?肽四聚體的實驗技術，利用MHC?肽四聚體成功地通過流式細胞儀在單個細胞水平上檢測特異性T細胞，為定量檢測特異性T細胞提供了新的有效手段。

據報道［3-5］，HLA?DRB1*07：01與天冬酰胺酶的超敏反應相關，攜帶HLA?DRB1*07：01基因型的人群有較高的風險對天冬酰胺酶過敏。對此，我們可以利用MHCⅡ?四聚體這一技術來體外確定HLA-DRB1*07：01與對天冬酰胺酶高親和力的表位肽，制備重組的表位肽疫苗，或通過突變把高親和力表位肽改造成低親和力肽，降低患者對天冬酰胺酶的免疫應答，也用于特異性免疫治療。此外，在對HLA?Ⅱ的研究中發(fā)現(xiàn)，HLA?DRB1*07：01這一基因型與許多疾病有關，比如白癜風［6-8］、拉帕替尼（用于晚期或轉移性乳腺癌的治療）誘導的肝損傷［9-11］、銀屑?。?2-14］等疾病相關，以及據本實驗室的生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，多種過敏原與HLA?DRB1*07：01的親和力均較強，與對應的過敏性疾病相關度高。因此，HLA?DRB1*07：01的表達純化和其MHC?Ⅱ四聚體的制備，對這些相關疾病的研究具有重要的意義和價值。

為使MHCⅡ的α亞基和β亞基可在體外二聚化，形成結構完整的MHCⅡ蛋白。本文在2個亞基跨膜區(qū)加入亮氨酸拉鏈，亮氨酸拉鏈是由伸展的氨基酸組成，每7個氨基酸殘基中的第7個氨基酸是亮氨酸，亮氨酸是疏水性氨基酸，排列在螺旋的一側，所有帶電荷的氨基酸殘基排在另一側。當2個蛋白質分子平行排列時，亮氨酸之間相互作用形成二聚體，形成“拉鏈”。為了獲得生物素化的MHCⅡ，在β鏈跨膜區(qū)加入Avi標簽，其由15個氨基酸殘基（GLNDIFEAQKIEWHE）組成，具有一個單生物素化賴氨酸位點，與已知天然可生物素化序列完全不同，融合表達后，可被生物素連接酶（如BirA）生物素化，可用于蛋白質分離純化和蛋白質相互作用研究。無論在體外或者體內，幾乎所有的蛋白都可以在一個獨特的Avi Tag位點輕易且有效地被生物素化。

1 材料與方法

1.1 材料DNA marker、限制性內切酶NdeⅠ和XhoⅠ購自TaKaRa公司，表達載體pET44a為實驗室保存，pETduet?1購自長沙愛科博生物科技有限公司，蛋白marker購自Thermo公司，T4連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司，Agarose購自上海海生公司，PVDF膜購自Millipore公司，兔抗HLA?DRA抗體購自Sigma公司（貨號：HPA050162?100 UL），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體購自CST公司（貨號：7074S），辣根過氧化物酶標記的鏈霉素抗體購自Abcam公司（貨號：ab7403），測序公司為廣州擎科生物技術有限公司，封閉液：5%脫脂奶粉，PBS溶解，包涵體洗液含100 mmol/L Tris?HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5%Triton X?100，pH 8.0。

1.2 HLA質粒的構建從Genbank中獲得HLA?DRB1*07：01的cDNA序列，人工合成基因片段時，α鏈、β鏈的跨膜區(qū)加入亮氨酸拉鏈，其中β鏈還在跨膜區(qū)加入Avi標簽。利用NdeⅠ和XhoⅠ將含目的基因HLA α鏈、β鏈的質粒和表達載體pET44a、pETduet?1?BirA雙酶切，PCR鑒定后，使用T4 DNA連接酶將HLA α鏈、β鏈分別構建于表達載體pET44a和pETduet?1?BirA上，然后轉至JM109中，于含有Amp的LB固體培養(yǎng)基涂平板，37℃過夜后，挑取單菌落做菌落PCR鑒定，α鏈的上游引物P1：5′?CATATGATCAAAGAAGAACATGTG?3′，下游引物P2：5′?CTCGAGTTATTAAGCAGCCAGGATG?3′，β鏈的上游引物 P3：5′?CATATGGGGGACACCCA?ACC?3′，下游引物 P4：5′?CTCGAGTTATTAATTGT?GCC?3′，BirA 的上游引物P5：5′?CGCGGATGAAG?GATAACACCGTG?3′，下游引物P6：5′?ACGCGTCG?ACTTATTTTTCTGCACTACG?3′，然后將陽性菌落接種于LB含Amp的液體培養(yǎng)基中，37℃搖（200 r/min）過夜后用于提取質粒和公司測序。

1.3 HLA的誘導表達將上述含有正確目的基因的 pET44a?HLA α鏈和 pETduet?1?HLA β鏈?BirA質粒分別轉化至表達菌株Rosetta中后，接種于含Amp的LB瓊脂平板中，37℃過夜后挑選陽性克隆后，在接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，按1∶50的量加入20%的葡萄糖，37℃搖菌至菌液OD600nm值約為0.6～0.8時，分別加入IPTG至終濃度為0.25 mmol/L，其中HLA β鏈的誘導需加入0.5 mmol/L生物素，37℃，200 r/min搖菌，誘導4 h后，各個收集1 mL菌液，10 000g，2 min離心后，去掉上清，制樣后沸水煮10 min，離心后SDS?PAGE電泳，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。

1.4 Western印跡鑒定HLA蛋白將上述樣品制樣電泳后，將凝膠上的條帶轉至PVDF膜上，轉膜后都加入封閉液室溫孵育1 h，封閉后HLA α鏈加入的一抗為兔抗HLA?DRA，二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，HLA β鏈只需孵育辣根過氧化物酶標記的鏈霉素抗體。

1.5 HLA蛋白的可溶性分析及純化將誘導后的菌體收集后，以 100 mmol/L Tris?HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA重懸，在冰浴中超聲裂解菌體。離心后分別收集上清和沉淀，利用SDS?PAGE電泳分析目的蛋白的可溶性后，用洗液洗滌包涵體3次，每次4℃攪拌30 min，在用不含TritonX?100的洗液洗1遍，最后再用6 mol/L尿素（含100 mmol/L Tris?HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA）變性溶解，通過SDS?PAGE分析各管組分。

2 結果

2.1 重組質粒的構建將含有目的基因的質粒經NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切和PCR鑒定大小正確（圖1、2）后，切膠回收，將HLA α鏈的基因片段連接到pET44a載體上，β 鏈的基因片段連到 pETduet?1?BirA上，轉入大腸桿菌JM109，涂板過夜后挑取單菌落做PCR鑒定，α鏈PCR產物電泳結果顯示在約750 bp，BirA的顯示約100 bp，β鏈的顯示在約750 bp處有特異性條帶擴增，大小均與目的基因相符，結果顯示重組質粒構建成功（圖3、4）。

圖 1 pUC57?HLA?DRB10701 α鏈雙酶切Fig.1 Identification of pUC57?HLA?DRB10701 α chain by digestion

圖2 pET44a?1?HLA?DRB10701 β鏈雙酶切Fig.2 Identification of pET44a?1?HLA?DRB10701 β chain by digestion

圖3 pET?44a?HLA?DRB10701 α鏈的PCR鑒定Fig.3 Identification of pET?44a?HLA?DRB10701 α chain by PCR

圖4 pETduet?1?HLA?DRB10701 β 鏈?BirA的PCR 鑒定Fig.4 Identification of pETduet?1?HLA?DRB10701 β chain?BirA by PCR

2.2 目的基因的誘導表達將含有目的基因的重組質粒轉入表達菌株Rosetta中，均加入終濃度為0.25 mmol/L的IPTG誘導4 h，取部分菌液制樣進行SDS?PAGE凝膠電泳，結果顯示加入IPTG后成功誘導表達分子量分別為34和29 kD，其分子量與目標蛋白的大小相符（圖5A、6A）。

2.3 Western印跡鑒定目的蛋白將誘導后的菌液制樣，經SDS?PAGE電泳后轉印至PVDF膜上，α鏈用兔抗HLA?DRA抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體為二抗，ECL顯色。生物素化的β鏈用辣根過氧化物酶標記的鏈霉素孵育，ECL顯色。結果顯示HLA?DRA和鏈霉素均可分別與目的蛋白結合，而未經誘導的菌液作為陰性對照，未見有結合條帶（圖5B、6B）。

2.4 目的蛋白的可溶性分析及純化菌體收集后，冰上超聲裂解，離心后分別取上清和沉淀制樣，利用SDS?PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)目的蛋白不溶（圖7），主要為包涵體表達，收集包涵體后洗滌3次，最后用6 mol/L尿素溶解得到變性蛋白。通過SDS?PAGE電泳分析蛋白純化效果，可見純化后蛋白純度較高（圖8）。

圖5 HLA?DRB10701 α鏈的誘導表達與Western blot分析Fig.5 Expression of HLA?DRB10701 α chain and Western blot analysis

圖6 可生物素化HLA?DRB10701 β鏈的誘導表達與Western blot分析Fig.6 Expression of Biotinylated HLA?DRB10701 β?chain and Western blot Analysis

圖7 重組HLA?DRB10701的可溶性分析Fig.7 Soluble analysis of recombinant HLA?DRB10701

圖8 純化前后HLA?DRB10701的SDS?PAGE電泳分析Fig.8 Analysis of HLA?DRB10701 by SDS?PAGE before and after purification

3 討論

MHCⅡ是由α鏈和β鏈組成的異源二聚體，2條鏈分別由HLAⅡ類α和β基因編碼，均具有多態(tài)性。2條多肽鏈的基本結構相似，氨基端在胞外，羧基端在胞內，胞外部分占整條鏈的2/3。α鏈和β鏈胞外部分可再分為2個結構域，稱為α1、α2和β1、β2，其中α1和β1構成肽結合槽，錨合抗原呈遞細胞（APC）中外源性抗原短肽，形成MHCⅡ類分子-肽復合物，轉運到細胞表面，與特異性CD4+T細胞表面的TCR結合，激活并使之發(fā)揮作用。

在早期許多學者對MHC分子體外結合多肽的研究沒有取得較好的效果，其原因之一是單個MHC?肽復合物（pMHC）與TCR的結合親和力低、解離速度快。而ALTMAN等［2］在研究中發(fā)現(xiàn)四分子的pMHC與TCR具有較強的親和力。MHCⅡ?肽四聚體是在Ⅱ類分子β鏈跨膜區(qū)及胞內區(qū)位置被末端帶有BirA酶底物肽（Avi）的亮氨酸拉鏈（leucine zipper motif）替代，誘導表達時加入生物素，利用BirA酶使其體內生物素化，再與α鏈、抗原肽折疊，形成可溶性MHC?肽單體分子，加入適當比例的鏈霉親和素，即可獲得穩(wěn)定的四聚體［15］。與現(xiàn)有的研究［16］在體外生物素化相比，本文在體內實現(xiàn)生物素化，具有更方便快捷，并減少不必要的實驗步驟就可實現(xiàn)生物素化的好處。

本實驗選用 pET?44a和 pETduet?1 表達載體，分別構建表達載體 pET?44a?HLA?DRB1*07：01 α鏈和 pETduet?1?HLA?DRB1*07：01 β 鏈?BirA 轉化至Rosetta中，經IPTG誘導表達。SDS?PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要存在于包涵體中，可以抵抗宿主細胞內的蛋白質酶的攻擊，免于大量降解。通過反復洗滌包涵體，去除大量可溶性雜蛋白，獲得高純度目的蛋白。此外，可參照AYYOUB等［17］設計含有一個His標簽的抗原肽，與MHCⅡ分子孵育后，利用親和層析獲得抗原肽與MHCⅡ分子形成穩(wěn)定的pMHC單體?？缮锘亟M表達蛋白HLA?DRB1*07：01的表達與純化，為進一步制備HLA?肽四聚體奠定了實驗基礎。

［1］龔非力.醫(yī)學免疫學［M］.北京：科學出版社，2014：15?16.

［2］ALTMAN J D，MOSS P A，GOULDER P J，et al.Phenotypic analysis of antigen ?specific T lymphocytes［J］.1998， 274（5284）：94?96.

［3］FERNANDEZ C A，SMITH C，YANG W，et al.HLA?DRB1*07：01 is associated with a higher risk of asparaginase allergies［J］.Blood，2014，124（8）：1266?1276.

［4］FERNANDEZ C A，SMITH C，YANG W，et al.HLA?DRB1*07：01 is associated with asparaginase allergies in children with acute lymphoblastic leukemia［J］.Blood，2013，126（1）：69?75.

［5］KUTSZEGI N，YANG X，GéZSI A，et al.HLA?DRB1*07：01?HLA?DQA1*02：01?HLA?DQB1*02：02 haplotype is associated with a high risk of asparaginase hypersensitivity in acute lym?phoblastic leukemia［J］.Haematologica，2017，102（9）：1578.

［6］HU D Y，REN Y Q，ZHU K J，et al.Comparisons of clinical features of HLA ?DRB1*07 positive and negative vitiligo pa?tients in Chinese Han population［J］.J Eur Acad Dermatol Ve?nereol，2011，25（11）：1299.

［7］陳軍，唐小輝，辛寧，等.HLA?DRB1*0701/02、DRB1*1201/02等位基因與新疆維吾爾族白癜風相關性研究［J］.醫(yī)學臨床研究，2011，28（2）：226?229.

［8］BEGUM R，MARFATIA Y S，LADDHA N C，et al.Vitiligo：a complex disease and a complex approach［J］.Mol Cytogenet，2014，7（S1）：I57.

［9］PARHAM L R，BRILEY L P，LI L，et al.Comprehensive ge?nome?wide evaluation of lapatinib?induced liver injury yields a single genetic signal centered on known risk allele HLA?DRB1*07：01［J］.Pharmacogenomics J ，2015，16（2）：180?185.

［10］SPRAGGS C F，PARHAM L R，HUNT C M，et al.Lapatinib?induced liver injury characterized by class II HLA and Gilbert's syndrome genotypes［J］.Clin Pharmacol Ther，2012，91（4）：647?652.

［11］SCHAID D J，SPRAGGS C F，MCDONNELL S K，et al.Pro?spective validation of HLA?DRB1*07：01 allele carriage as a predictive risk factor for lapatinib?induced liver injury［J］.J Clin Oncol，2014，32（22）：2296?2303.

［12］JEE S H，TSAI T F，TSAI W L，et al.HLA?DRB1*0701 and DRB1*1401 are associated with genetic susceptibility to psoria?sis vulgaris in a Taiwanese population［J］.Br J Dermatol，1998，139（6）：978.

［13］GHEUENS S，F(xiàn)ELLAY J，GOLDSTEIN D B，et al.Role of hu?man leukocyte antigen class I alleles in progressive multifocal leukoencephalopathy［J］.J Neurovirol，2010，16（1）：41?47.

［14］張慶瑞.The Relationship of HLA?DRB1 0701 Allele with the Psoriasis Vulgari［J］.Chin Med Sci J，1999，14（2）：70.

［15］JUSTESEN S，HARNDAHL M，LAMBERTH K，et al.Func?tional recombinant MHC class II molecules and high?throughput peptide?binding assays［J］.Immunome Res，2009，5：2.

［16］錢亞云，劉靜，張偉，等.可生物素化H?2K～d?BSP融合蛋白的原核表達和純化［J］.實用臨床醫(yī)藥雜志，2008，12（7）：1?4.

［17］AYYOUB M，DOJCINOVIC D，PIGNON P，et al.Monitoring of NY?ESO?1 specific CD4+T cells using molecularly defined MHC class II/His?tag?peptide tetramers［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（16）：7437?7442.