李莉，李濤

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科，四川 瀘州 646000）

妊娠滋養(yǎng)細胞疾病（gestational trophoblastic disease，GTD）是一組來源于胚胎滋養(yǎng)細胞的疾病，根據(jù)組織學(xué)將其分為葡萄胎（hydatidiform mole，HM）、侵蝕性葡萄胎（invasive mole，IM）、妊娠性絨毛膜癌（gestational choriocarcinoma，GCC）及胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤[1]。而侵蝕性葡萄胎、妊娠性絨毛膜癌和胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤又統(tǒng)稱為妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤（gestational trophoblastic neoplasia，GTN）。GTN可繼發(fā)于葡萄胎、流產(chǎn)、異位妊娠及足月產(chǎn)等，其中約60%來源于葡萄胎[2]。一些腫瘤細胞擁有能力穿透血管壁，在血液中循環(huán)，達到身體的其他領(lǐng)域。這些循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）是血行轉(zhuǎn)移和腫瘤進展的重要原因之一[3]。因此檢測患者外周血循環(huán)腫瘤細胞可能對評估GTN早期血行轉(zhuǎn)移、檢測治療和預(yù)后起重要作用。

人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）是由α和β 2條多肽鏈通過非共價鍵結(jié)合，β亞基決定其免疫特性[4]，人絨毛膜促性腺激素β亞基（human chorionic gonadotropin beta subunit，CGB）作為妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤標(biāo)志物之一，長期被用于GTN的診斷、療效評估和隨訪。人類促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone，GnRH）是由下丘腦分泌的十肽激素，在性成熟和生殖繁育能力方面起重要作用。人體中存在2種亞型GnRH1和GnRH2，在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌和前列腺癌中GnRH1表達水平升高[5]，并且已證明GnRH1的受體激動劑可以抑制卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的增殖，促進細胞凋亡[6]。有研究表明在子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜非典型增生時CGB的表達增加同時伴有GnRH1表達增加[7]。

本研究通過采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測GTN患者血清CGB和GnRH1 mRNA表達情況，探討其表達與腫瘤轉(zhuǎn)移的相互關(guān)系，尋找診斷GTN患者早期血行轉(zhuǎn)移的可能標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年1月-2015年6月西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、四川省遂寧市射洪縣人民醫(yī)院和四川省腫瘤醫(yī)院3所醫(yī)院腫瘤科門診確診的GTN患者52例（GTN組）和HM患者21例（HM組），同期體檢正常妊娠婦女20例（正常妊娠組）和非妊娠婦女20例（非妊娠組）的基本臨床資料及外周血5 ml。52例GTN患者，年齡16～42歲，平均（29.7±0.31）歲；末次妊娠為葡萄胎者41例（78.8%），流產(chǎn)9例（17.3%），異位妊娠1例（1.9%），足月產(chǎn)1例（1.9%）。

1.1.1 GTN組 納入標(biāo)準(zhǔn)：①初診的妊娠性絨毛膜癌、侵蝕性葡萄胎或中間型滋養(yǎng)細胞腫瘤患者；②經(jīng)B超、影像學(xué)或病理學(xué)診斷確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①已接受藥物或手術(shù)治療的GTN患者；②不能配合研究抽取外周血的患者；③非妊娠性絨毛膜癌患者；④其他腫瘤病史者。

1.1.2 HM組 納入標(biāo)準(zhǔn)：初診經(jīng)B超、影像學(xué)或病理學(xué)確診的葡萄胎患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：已接受過藥物或手術(shù)治療；其他腫瘤病史者。

1.1.3 正常妊娠組 納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)血β-HCG和B超確診的孕8～12周正常妊娠婦女。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有葡萄胎病史；既往有其他腫瘤病史。

1.2 GTN的診斷及FIGO分期

根據(jù)患者妊娠后（包括葡萄胎組織排空以后或流產(chǎn)、異位妊娠及足月產(chǎn)后）出現(xiàn)的相應(yīng)癥狀和體征（如陰道流血，肺轉(zhuǎn)移等），結(jié)合患者的血清HCG水平，GTN的診斷可以確定，影像學(xué)和組織學(xué)檢測對診斷是非必須的。FIGO分期：所有患者依據(jù)國際婦產(chǎn)科協(xié)會（the International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）2002年頒布的新的標(biāo)準(zhǔn)進行分期及預(yù)后評分[8-9]，0～6分為低危，≥7分為高危。

1.3 總RNA提取及RT-PCR

RNA提取試劑盒RNAfast 200購自上海飛捷生物科技有限公司，RT-PCR試劑盒[Prime Script? RT reagent Kit（Perfect Real Time）]及 real-time PCR 試劑盒[SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）]均購自寶生物工程（大連）有限公司。CGB引物（正向5'-AGCCAAAGACCGCTACG-3'；反向5'-TG AGGGGACAAGCTACCG-3’），GnRH1引物（正向5'-GACCTGAAAGGACTCTGGA-3'；反向 5'-CTTCTGGCC CAATGGATTTA-3'）[10]均由上海吉瑪生物科技有限公司合成。按RNAfast 200說明書分別提取血液中總RNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測，OD260/OD280者為合格樣品。取500 ng總RNA為模板，按RT-PCR試劑盒說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，RNA水平使用2-??Ct方法相對定量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較使用q檢驗，計數(shù)資料采用例表示，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GTN組、HM組、正常妊娠組及非妊娠組血清CGB和GnRH1 mRNA表達情況

各組CGB mRNA、GnRH1 mRNA RT-PCR典型條帶圖見圖1、2。20例非妊娠組血清中CGB mRNA陰性，GnRH1 mRNA表達較少；20例正常妊娠組CGB mRNA和GAPDH mRNA 較少量表達；21例HM組和52例GTN組CGB mRNA和GAPDH mRNA表達均有所升高。4組患者血清CGB mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H=9.748，P=0.005），說明4組血液中CGB mRNA表達水平不同，GTN組血清中CGB mRNA水平高于其余3組。4組血清GnRH1 mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H=6.522，P=0.018），說明4組血液中GnRH1 mRNA表達水平不同，GTN組血清中GnRH1 mRNA水平升高，見表1。

2.2 GTN組血清CGB mRNA表達與臨床指標(biāo)的關(guān)系

根據(jù)臨床指標(biāo)中年齡、前次妊娠、最大腫瘤大小、遠處轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移灶數(shù)目、臨床分期、預(yù)后評分等因素分組。分別比較不同組中血清CGB mRNA表達情況。其中CGB mRNA表達與年齡、前次妊娠、最大腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05）；與遠處轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移灶數(shù)目、臨床分期、FIGO預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）。見表2。

2.3 GTN組血清GnRH1 mRNA表達與臨床指標(biāo)的關(guān)系

根據(jù)臨床指標(biāo)中年齡、前次妊娠、最大腫瘤大小、遠處轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移灶數(shù)目、臨床分期、預(yù)后評分等因素分組。分別比較不同分組中血清GnRH1 mRNA表達情況。其中GnRH1 mRNA表達與年齡、前次妊娠、最大腫瘤大小、轉(zhuǎn)移灶數(shù)目無關(guān)（P＞0.05）；與遠處轉(zhuǎn)移、臨床分期、FIGO預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

圖1 GnRH1 mRNA RT-PCR條帶圖

圖2 CGB mRNA RT-PCR條帶圖

表1 各組血清CGB和GnRH1 mRNA表達情況

表2 GTN組血清CGB mRNA表達與臨床指標(biāo)的關(guān)系

3 討論

GTN是胚胎的滋養(yǎng)細胞發(fā)生惡變而形成的腫瘤，包括中間型滋養(yǎng)細胞腫瘤、侵蝕性葡萄胎和妊娠性絨毛膜癌。妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤患者死亡的重要原因多數(shù)是發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，如肺轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移等。一些腫瘤細胞擁有能力穿透血管壁，在血液中循環(huán)，到達身體的其他領(lǐng)域。CTC反映了腫瘤的侵犯，因此早期發(fā)現(xiàn)血液中的CTC，對于患者預(yù)后判斷、療效評價和個體化治療都有著重要的指導(dǎo)作用。GTN是胚胎的滋養(yǎng)細胞發(fā)生惡變，因此外周血中檢測惡變的細胞滋養(yǎng)細胞和合體滋養(yǎng)細胞，有助于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤血行轉(zhuǎn)移。目前，直接檢測腫瘤細胞技術(shù)較為復(fù)雜，檢測周期較長，臨床推廣困難，因此檢測外周血中循環(huán)腫瘤細胞的重要任務(wù)是尋找其特異性標(biāo)志物。國外對于檢測妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤外周血循環(huán)腫瘤細胞的相關(guān)研究報道較多，而針對國人的報道則較少[11-12]，本研究納入4組不同人群，收集臨床資料和外周血，使用RTPCR檢測各組患者血清CGB和GnRH1 mRNA表達情況，分析其與妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤早期轉(zhuǎn)移等臨床參數(shù)的關(guān)系，探究其與妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤血行轉(zhuǎn)移的相互關(guān)系。

表3 GTN組血清GnRH1 mRNA表達與臨床指標(biāo)的關(guān)系

CGB是有胎盤合體滋養(yǎng)細胞分泌的一種糖蛋白。本研究顯示非妊娠組外周血中無CGB mRNA表達，GTN組外周血中CGB mRNA表達水平高于HM組、正常妊娠組。GTN組外周血中GnRH1 mRNA表達水平高于HM組、正常妊娠組和非妊娠組。提示CGB和GnRH1表達可能作為妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤檢測的標(biāo)志物之一。

本研究顯示，GTN組外周血CGB mRNA 表達陽性與年齡、前次妊娠、最大腫瘤大小無關(guān)；與遠處轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移灶數(shù)目、臨床分期、FIGO預(yù)后相關(guān)。GnRH1 mRNA表達陽性與年齡、前次妊娠、最大腫瘤大小、轉(zhuǎn)移灶數(shù)目無關(guān)；與遠處轉(zhuǎn)移、臨床分期和FIGO預(yù)后相關(guān)。CGB mRNA和GnRH1 mRNA表達陽性有遠處轉(zhuǎn)移組患者高于無遠處轉(zhuǎn)移組，臨床分期Ⅲ組高于臨床分期Ⅰ、Ⅱ組，F(xiàn)IGO高危組高于FIGO低危組，這些均提示外周血CGB mRNA和GnRH1 mRNA表達與轉(zhuǎn)移相關(guān)臨床指標(biāo)相關(guān)，因此CGB和GnRH1可能成為評估妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤早期血行轉(zhuǎn)移的有效評價指標(biāo)。

參 考 文 獻：

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