張書芬，畢曉麗，應(yīng)璐，周子焱，邢家溧，滿正印，沈堅(jiān)

（寧波市食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，浙江寧波 315040）

0 引言

低聚果糖是一種天然活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)腸道菌群，增殖雙歧桿菌，促進(jìn)鈣吸收，調(diào)節(jié)免疫，抗齲齒等功能[1]。同時(shí)，GB 14880-2012[2]中也明確規(guī)定了其在嬰幼兒配方食品中使用的最大限量不超過64.5 g/kg。

目前，低聚果糖檢測(cè)方法的研究主要集中在液相色譜和離子色譜上[3-14]。其大多以蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖為目標(biāo)物，外標(biāo)法進(jìn)行定量。這種方法僅適用于檢測(cè)產(chǎn)品中添加了以蔗糖為原料，利用果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用轉(zhuǎn)化而成的低聚果糖的檢測(cè)。而不適用于以菊苣或菊芋為原料，經(jīng)酶解或酸解而生成的聚合度為2～9的低聚果糖的檢測(cè)[15]。2017年新實(shí)施的國(guó)標(biāo)GB 5009.255-2016[5]的檢測(cè)方法雖然能檢測(cè)低聚果糖的總量，但該方法需要配有三元及以上梯度泵,脈沖安培檢測(cè)器的離子色譜儀，設(shè)備價(jià)格昂貴，且專用性強(qiáng)，所以不適于推廣。本文在參考AOAC 997.08[16]及國(guó)標(biāo)中酶解法原理的基礎(chǔ)上，建立了一種對(duì)嬰幼兒配方乳粉中低聚果糖總量進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)用方法。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 主要儀器

安捷倫1260液相色譜儀（具有蒸發(fā)光散射檢測(cè)器）；艾卡渦旋振蕩器；德國(guó)優(yōu)萊博恒溫水浴搖床；Therm o離心機(jī)。

1.2 材料

1.2.1 試劑

果糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度≥99.0%），果聚糖酶（外切酶活力20 000 U）；蔗糖酶（酶活力300 U），乙腈為色譜純，實(shí)驗(yàn)室用水為超純水；氫氧化鈉、馬來酸鈉、乙酸、硼氫化鈉等其他試劑均為分析純。

1.2.2 試劑的配制

(1)硼氫化鈉溶液(質(zhì)量濃度10m g/m L):準(zhǔn)確稱取適量硼氫化鈉(精確至0.001 g)于聚丙烯離心管中,用濃度為50mm ol/L氫氧化鈉溶液溶解,用時(shí)現(xiàn)配。

(2)蔗糖酶溶液(5.0 U/m L)∶將蔗糖酶(活力為300 U)溶解于60m L馬來酸鈉緩沖溶液(濃度100mm ol/L,pH=6.5)中,分裝到2m L的離心管中,-20℃保存,可放置6個(gè)月。

（3）乙酸鈉緩沖溶液(pH=4.5)∶吸取14 m L乙酸溶液(濃度為200 mm o l/L)和11 m L乙酸鈉溶液(200 mm ol/L)混合,并用水稀釋至50m L,用時(shí)現(xiàn)配。

（4）果聚糖酶溶液(500 U/m L)∶將果聚糖酶(活力為20 000 U)溶解于40 m L乙酸鈉緩沖溶液,分裝到2 m L的離心管中,-20℃保存,可放置6個(gè)月。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Carbohydrate糖分析專用柱（250 mm×4.6 mm,5μm），流動(dòng)相（乙腈∶水=85∶15），流速為1.0 m L/m in， 進(jìn)樣體積為20μL，柱溫為40℃。

檢測(cè)器條件:霧化溫度為85℃，霧化器流量為1.6 m L/m in，增益為8.0。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g左右試樣于錐形瓶中,加入80℃熱水約30m L,置于80℃±1℃恒溫水浴搖床中,150 r/m in振搖15 m in后,冷至室溫轉(zhuǎn)移定容至50 m L容量瓶中，過濾或離心備用。根據(jù)樣品中低聚果糖的具體含量和標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍確定稀釋倍數(shù)。

若樣品中含有蔗糖，取上述樣液300μL于10m L具塞玻璃試管中,按每毫克蔗糖加入125μL蔗糖酶溶液(5.0 U/m L)加入蔗糖酶溶液,旋渦振蕩混勻,置于40℃±1℃恒溫水浴搖中,150 r/m in振搖60 m in后,加入300μL硼氫化鈉溶液,繼續(xù)振搖30 m in后,取出,冷卻至室溫后加入750μL乙酸溶液,靜置10m in。按每毫克低聚果糖加入250μL果聚糖酶溶液(500 U/m L)加入果聚糖酶溶液,旋渦振蕩混勻,于上述同樣條件下振搖30 m in冷卻至室溫后定容至2.5 m L，過0.22μm水相濾膜上機(jī)待測(cè)。若樣品中不含蔗糖，取上述樣液300μL于10m L具塞玻璃試管中，直接加入果聚糖酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解條件的優(yōu)化

前處理過程蔗糖酶用來酶解樣品中蔗糖使其水解成果糖和葡萄糖，生成的葡萄糖和果糖經(jīng)硼氫化鈉還原成相應(yīng)的糖醇，而樣品中的低聚果糖不受酶解和還原影響，樣品中的低聚果糖經(jīng)過果聚糖酶水解成果糖和葡萄糖,經(jīng)HPLC-ELSD測(cè)定果糖含量,通過折算得到果聚糖的含量。由于果聚糖酶也能夠一定程度上水解蔗糖，所以如果蔗糖水解不完全，將會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，使檢測(cè)數(shù)據(jù)偏高。果聚糖酶如果添加不夠，水解不完全，將使低聚果糖不能完全被檢測(cè)到，從而使檢測(cè)結(jié)果偏低，所以酶解條件的優(yōu)化十分重要。

在300μL樣品稀釋液中添加1 m g蔗糖，加入不同量的蔗糖酶進(jìn)行酶解，通過測(cè)定生成的果糖含量的變化來確定每毫克蔗糖需要的蔗糖酶的量。同理，對(duì)每毫克低聚果糖需要的果聚糖酶量進(jìn)行考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，每毫克蔗糖中加入125μL蔗糖酶，每毫克低聚果糖中加入250μL果聚糖酶可以達(dá)到完全酶解的效果。

趙丹霞[17]等人的研究表明，嬰兒奶粉一般不添加蔗糖，較大嬰幼兒奶粉中一般不超過10 g/100 g。低聚果糖添加量一般為1～3 g/100 g之間，GB14880-2012規(guī)定低聚果糖與低聚半乳糖等添加總量不超過6.45 g/100 g。按照實(shí)驗(yàn)考察出的酶的酶解能力計(jì)算，在嬰幼兒配方乳粉中蔗糖酶的添加量一般不超過375μL，果聚糖酶的添加量一般不超過500μL。

圖1 蔗糖酶和低聚果糖酶加入量對(duì)果糖檢測(cè)結(jié)果的影響

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱及的流動(dòng)相比例的優(yōu)化

果糖、葡萄糖等糖類一般選用氨基柱進(jìn)行檢測(cè)。本文分別采用氨基柱和ZORBAX Carbohydrate糖分析專用柱進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)表明，兩根色譜柱都能對(duì)果糖、與葡萄糖和糖醇進(jìn)行分離，但都不能將葡萄糖和糖醇分離，由于實(shí)驗(yàn)中是通過測(cè)定果糖含量后，通過折算來測(cè)定低聚果糖總量，所以從分離角度，兩根色譜柱都能滿足分離要求。但相同測(cè)定條件下，氨基柱基線噪音明顯高于糖分析專用柱，這可能是由于糖分析專用柱是在氨基柱的基礎(chǔ)上添加了乙?；?，使柱流失減小的緣故，故本文選用ZORBAX Carbohydrate糖分析專用柱作為測(cè)試柱。

蒸發(fā)光檢測(cè)器的檢測(cè)原理決定其需使用易揮發(fā)的流動(dòng)相，一般不添加無機(jī)鹽。本文選用水和乙腈作為流動(dòng)相。在本文色譜條件下，通過考察各組分的分離程度、果糖的峰形、基線噪音三方面來優(yōu)化流動(dòng)相比例。試驗(yàn)考察了四組乙腈與水不同比例的情況，具體效果如圖2所示。

圖2 不同流動(dòng)相比例的色譜

由圖2可以看出，隨著流動(dòng)相中水相比例降低，儀器的基線噪音越低，并且果糖與葡萄糖和糖醇的分離度更好，但同時(shí)色譜峰延展變寬，且隨著水相的比例增加響應(yīng)值變低。為了保證良好的分離度、峰形和較低的基線噪音，本研究選擇乙睛∶水為85∶15的流動(dòng)相比例。

2.2.1 蒸發(fā)光檢測(cè)器霧化氣流量的選擇

作為通用型檢測(cè)器，蒸發(fā)光檢測(cè)器其響應(yīng)不依賴于樣品的光學(xué)特性，任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品經(jīng)霧化蒸發(fā)后得到的顆粒散射光后均能被檢測(cè)。霧化氣流小，可以形成較大的霧滴，有利于散射光的增強(qiáng)，目標(biāo)物響應(yīng)增強(qiáng)。但霧化氣流過小會(huì)使流動(dòng)相揮發(fā)不完全，背景、基線增高，污染檢測(cè)器。所以試驗(yàn)中分別選取1.4,1.6，1.8，2.0 m L/m in霧化氣流量進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)霧化氣流量為1.6 m L/m in時(shí)，在背景干擾、基線噪音和響應(yīng)之間達(dá)到了一個(gè)比較好的平衡。

2.3 檢測(cè)結(jié)果的折算

試驗(yàn)中直接測(cè)定結(jié)果為果糖含量，折算成低聚果糖采用GB5009.255-2016中的計(jì)算公式，低聚果糖聚合度以4計(jì)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

用純水配制20，50，80，100，1500，300 m g/L質(zhì)量濃度的果糖標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在選定的色譜條件下上機(jī)，獲得冪函數(shù)方程為y=35.46120x1.08788（其中y為峰面積，x為果糖質(zhì)量濃度），相關(guān)系數(shù)r=0.99957。

另外，還考察了方法的檢出限和定量限，當(dāng)信噪比（S/N）為3時(shí)，果糖的上機(jī)檢出限為10 m g/L，折算成低聚果糖的檢出限為1.0 g/kg，低聚果糖的定量限為3.0 g/kg。

2.5 精密度和回收率

在未添加低聚果糖的嬰幼兒配方乳粉樣品中添加定量限、5倍定量限和國(guó)標(biāo)限量水平質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)樣，按選定試驗(yàn)方法進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)樣品平行測(cè)定6次，結(jié)果如表1所示。

2.6 樣品分析與國(guó)標(biāo)對(duì)比

對(duì)標(biāo)簽中明示添加了低聚果糖的5批嬰幼兒配方乳粉進(jìn)行測(cè)試，并外送樣品按照GB5009.255-2016標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，本方法與國(guó)標(biāo)方法比較結(jié)果如表2所示。

表1 低聚果糖在嬰幼兒配方乳粉中的回收率和精密度

表2 本文方法和國(guó)標(biāo)方法測(cè)定結(jié)果比較

3 結(jié) 論

通過酶加入量、色譜柱、流動(dòng)相比例、霧化氣流量等條件的優(yōu)化，首次建立了一種高效液相色譜蒸發(fā)光檢測(cè)器測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中低聚果糖總量的方法。該法準(zhǔn)確可靠，三水平加標(biāo)回收率均在86.7%～105.1%之間。檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法具有一致性，5批次實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果和國(guó)標(biāo)方法對(duì)比，絕對(duì)偏差均小于8%。由于該法使用儀器設(shè)備價(jià)格低，實(shí)驗(yàn)室基本配備，比國(guó)標(biāo)方法更具有實(shí)際應(yīng)用和推廣價(jià)值。為低聚果糖的檢測(cè)及推廣應(yīng)用提供一定的參考，為營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽的規(guī)范標(biāo)識(shí)提供技術(shù)支持。

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