王震,姚美伊，凌云，李曉娟，李奇峰，陳達

（1.天津大學精密儀器與光電子工程學院，天津 300071；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

0 引言

乳清蛋白的兩種主要成分是α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，對嬰幼兒的睡眠及神經(jīng)發(fā)育具有重要作用。傳統(tǒng)的檢測方法有毛細管電泳法[1]、十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳法[2]、高效液相色譜法[3]、反相高效液相色譜法[4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]等，但因乳清蛋白在嬰幼兒配方奶粉中存在變性的狀態(tài)，傳統(tǒng)方法無法測定總蛋白含量[6]。

Zhang等[7]研究表明α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的特異肽段不受蛋白質(zhì)變性狀態(tài)的影響，可用于兩種蛋白質(zhì)的準確定量，α-乳白蛋白的特異肽段序列為VG INYW LAHK內(nèi)標物序列為VGI*NYWL*AHK，β-乳球蛋白的特異肽段序列為IDALNENK及內(nèi)標物為I*DAL*NENK。

因此本研究以兩種蛋白的同位素特異肽作為內(nèi)標，采用液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法對兩種蛋白進行了定量，并驗證了方法的穩(wěn)定性。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

甲酸、乙腈（色譜純），實驗用水為M illi-Q超純水；標準品采用牛功能蛋白檢測試劑盒包括α-乳白蛋白特異肽（2.0μm o l/L，分子量 1199.7 u）、β-乳球蛋白特異肽（4.0μm ol/L，分子量915.5 u）、α-乳白蛋白同位素特異肽（2.0μm ol/L，分子量 1214.4 u）、β-乳球蛋白同位素特異肽（4.0μm o l/L，分子量929.5 u）、α-乳白蛋白同位素標記內(nèi)標（2.0μm o l/L，分子量2784.39 u）、β-乳球蛋白同位素內(nèi)標（4.0μm o l/L，分子量3346.93 u）、牛胰蛋白酶溶液（500μg/m L）、碳酸氫銨（NH4HCO3）溶液（500 mm ol/L）、碘代乙酰胺（IAA）溶液（500 mm o l/L）、二硫蘇糖醇（DTT）溶液（500 mm ol/L）、氯化鈣（CaC l2）溶液（100 mm o l/L）。奶粉樣品共13個（包括嬰幼兒配方奶粉樣品8個，用于配制嬰幼兒配方奶粉的乳清蛋白原料3個，脫脂奶粉原料2個）。

1.2 儀器與設(shè)備

WA TERSACQU ITYTM超高效液相色譜儀，質(zhì)譜儀QTRAP 5500，TRIPLE QUAD 4500，QTRAP4000，XE VOTM TQ，M S 6490；天平（PL203，感量0.01 g）；超聲振蕩器（KQ-500型）；渦旋混合器（VORTEX-QILINBEIER-5）；恒溫水浴鍋（B-491）,超純水儀（Milli-Q公司）；容量瓶（100 m L，10 m L）；離心管（2 m L）；聚丙烯樣品瓶（2009 p-1232-100，2 m L）；移液槍頭（10，200，1 000μL）；移液管（10 m L）。

1.3方法

1.3.1 樣品前處理

參照牛功能蛋白檢測試劑盒（Realgoal HA15004）[6]。稱取固體樣品2 g(精確至0.01 g)于100 m L容量瓶中，用90 m L水將樣品充分溶解，置于渦旋混合器或超聲波震蕩器中短時溶解，并用水定容至刻度。混勻后移取1.0 m L上述樣品并用水定容至10 m L，再次混勻后準確移取200μL試樣于2 m L離心管中，加入50 m L同位素內(nèi)標中間混合液，150μL碳酸氫銨溶液、10μL DTT溶液，混勻后置于75℃恒溫水浴30m in；冷卻至室溫，加入30μL的IAA溶液，暗處靜置30m in；再加入10μL的CaC l2溶液、50μL牛胰蛋白酶溶液、充分混勻后置于37℃恒溫水浴鍋中酶解5 h，用10μL甲酸混勻，室溫下靜置15 m in，加入490μL水，渦旋混勻。供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

1.3.2 儀器工作條件

色譜條件：色譜柱 ACQU ILTY UPLC Peptide BEH C 18，1.7μm，2.1 mm×100 mm，流動相A為0.1%甲酸-水，B為0.1%甲酸-乙腈；柱溫40℃；進樣量5.0μL；梯度洗脫：0～0.8m in,5%B,0.8～1.2m in,5%～10%B,1.2～2.5 m in,10%～17%B,2.5～2.6 m in,17%～23%B,2.6～3.8m in,23%B,3.8～4.0 m in,23%～100%B,4.0～4.8 m in,100%B,4.8～5.0m in,100%～5%B,5.0～5.7m in 5%B。

質(zhì)譜條件(AB5500)：電噴霧電離源,正離子模式,多反應(yīng)監(jiān)測，氣簾氣:40霧化氣:40,輔助氣:50,電噴霧電壓:5500,去溶劑溫度:450。

1.3.3 標準曲線的繪制

配置α-乳白蛋白特異肽段濃度為：5，25，75，150，300，500 nm ol/L；內(nèi)標法添加α-乳白蛋白同位素特異肽段濃度為100 nm o l/L。配置β-乳球蛋白特異肽段濃度為：10，50，150，300，600，1 000 nm o l/L；內(nèi)標法添加β-乳球蛋白同位素特異肽段的濃度為200 nm ol/L。

1.3.4 方法的實驗室內(nèi)重復性

分別在5個實驗室采用5種不同的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀開展實驗室內(nèi)的日內(nèi)及日間重復性試驗，對同一種奶粉進行每天六次平行測定實驗，連續(xù)測定3 d，并按照公式（1）計算α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的質(zhì)量濃度：

式中：X：為試樣中牛α-乳白蛋白，或β-乳球蛋白的質(zhì)量分數(shù)；ρ為根據(jù)標準曲線計算得到的試樣酶解液中牛α-乳白蛋白，或β-乳球蛋白的質(zhì)量濃度；V為試樣的定容體積；m為試樣質(zhì)量；f1為待測試樣溶液的稀釋倍數(shù)；10-4為將質(zhì)量濃度單位μg/m L換算為m g/m L的換算系數(shù)。

1.3.5 方法的實驗室間再現(xiàn)性

按照前處理方法，分別在5個實驗室分別測試13種奶粉樣品，每個樣品平行測定兩次，根據(jù)公式（1）計算α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的質(zhì)量濃度，然后計算每個樣品測試結(jié)果計算相對標準偏差（RSD）和再現(xiàn)性限（R），考察方法針對不同樣品的實驗室間再現(xiàn)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 同位素特異肽在5種不同質(zhì)譜儀上的質(zhì)荷比優(yōu)化結(jié)果

α-乳白蛋白及β-乳球蛋白的特異肽段及同位素特異肽段的質(zhì)譜信息如表1～表5所示。在5種不同質(zhì)譜儀器上蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比的差異小于0.2,但離子信號強度有所差異，如質(zhì)譜儀QTRAP 5500產(chǎn)生的子離子355.3的信號強度要高于子離子284.3的強度，而在其他幾臺質(zhì)譜儀器上子離子284.3的信號強度更高，可根據(jù)不同儀器選取定量離子對。

表1 質(zhì)譜儀型號為QTRAP 5500，AB SCIEX的MRM質(zhì)譜參數(shù)

表2 質(zhì)譜儀型號為TR IPLEQUAD4500,ABSCIEX的MRM質(zhì)譜參數(shù)

2.2 離子流圖

在QTRAP5500 AB儀器上，利用ESI+模式對α-乳白蛋白特異肽、β-乳球蛋白特異肽及兩種同位素內(nèi)標的離子流圖進行了監(jiān)測，結(jié)果如圖1所示。因α-乳白蛋白特異肽、β-乳球蛋白特異肽及其內(nèi)標因具有相同的分子結(jié)構(gòu)，因此在色譜保留時間上具有一致性，兩組蛋白的保留時間分別是4.02 m in和2.76 m in。但可通過內(nèi)標物與特異肽的質(zhì)量數(shù)對兩者進行區(qū)分。

表3 質(zhì)譜儀型號為QTRAP4000,AB SCIEX的MRM質(zhì)譜參數(shù)

表4 質(zhì)譜儀型號為XEVOTM TQ,WATERS的MRM質(zhì)譜參數(shù)

表5 質(zhì)譜儀型號為MS6490,Agilent的MRM質(zhì)譜參數(shù)

圖1 多級監(jiān)測離子流

2.3 線性關(guān)系

內(nèi)標法采用特異肽的面積與同位素特異肽峰面積比值作為縱坐標，以濃度為橫坐標進行線性回歸，得到α-乳白蛋白特異肽的回歸方程y=0.00768x-0.0297,R2=0.9954.得到β-乳球蛋白特異肽段的回歸方程y=0.00578x-0.0202,R2=0.9974.表明兩種蛋白質(zhì)均具有良好的線性關(guān)系，可用于定量分析。

2.4 方法的實驗室內(nèi)重復性

表6列出了5個不同實驗室開展實驗室內(nèi)的實驗室內(nèi)日內(nèi)及日間重復性考察結(jié)果，α-乳白蛋白的日內(nèi)RSD在1.23%～10.1%之間，日間RSD在4.13%～12.2%之間；β-乳球蛋白日內(nèi)RSD在1.06%～10.3%之間，日間RSD在1.52%～12.0%之間。

2.5 方法的實驗室間再現(xiàn)性

表7和表8為所有樣品（共13個，包括嬰幼兒配方奶粉樣品8個，用于配制嬰幼兒配方奶粉的乳清蛋白原料3個，脫脂奶粉原料2個）在5種儀器上的測定結(jié)果。表7和表8中，每個樣品測試結(jié)果計算再現(xiàn)性限（R），考察方法針對不同樣品的實驗室間再現(xiàn)性，結(jié)果表明，對于α-乳白蛋白，RSD在10.4%～18.4%之間。平均測定值小于1.0%的5個樣品，再現(xiàn)性限（R）在0.19～0.44之間，平均測定值在1.0%～2.0%的6個樣品，再現(xiàn)性限（R）在0.49～0.77之間，對于α-乳白蛋白含量較高的2個樣品，平均測定值分別為9.71%和30.2%，再現(xiàn)性限（R）分別為3.58和16.7。對于β-乳球蛋白，RSD在10.7%～23.6%之間。其中1個含量較低的樣品，平均測定值為1.34%時，再現(xiàn)性限（R）為0.71，平均值在2.85%～3.89%的8個樣品，再現(xiàn)性限（R）在1.03～2.36之間，對于質(zhì)量分數(shù)較高的3個樣品，平均測定值分別為6.38%，15.9%，34.1%；再現(xiàn)性限（R）分別為3.50，9.51，20.5。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種測定嬰幼兒奶粉中變性及非變性的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白總量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，此方法采用同位素特異肽作為內(nèi)標物，利用C 18色譜柱對α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的特異肽進行了分離，兩種蛋白的線性關(guān)系良好可以進行定量測定，實驗室內(nèi)重復性標準偏差在1.06%～12.2%，實驗室間再現(xiàn)性標準偏差為10.4%～23.6%。傳統(tǒng)方法只能測定非變性的乳清蛋白成分，本研究彌補了這一不足之處，提供了一種準確測定總?cè)榍宓鞍壮煞值姆椒?，并在不同液相質(zhì)譜儀器上進行了應(yīng)用，為嬰幼兒奶粉中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的檢測提供方法參考。

表6 方法的重復性考察%

表7 α-乳白蛋白測定的實驗室間再現(xiàn)性考察結(jié)果 %

表8 β-乳球蛋白測定的實驗室間再現(xiàn)性考察結(jié)果 %

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