劉萌萌，宋戈

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，哈爾濱150028）

0 引言

乳果糖是牛乳在加熱過程中，乳糖在酪蛋白游離氨基的催化下，堿基異構(gòu)化形成的一種雙糖，是判定復(fù)原乳的重要指標(biāo)[1-2]。我國(guó)有文件規(guī)定凡在產(chǎn)品生產(chǎn)加工過程中使用復(fù)原乳的企業(yè)必須在其產(chǎn)品包裝上醒目標(biāo)注復(fù)原乳以便于消費(fèi)者作出購買選擇[3]。目前,國(guó)家農(nóng)業(yè)部頒布檢測(cè)乳果糖的標(biāo)準(zhǔn)[4]是酶解-分光光度法，對(duì)試劑和酶要求高，而文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定乳果糖含量的方法有高效液相色譜示差檢測(cè)法[5-6]、離子色譜電化學(xué)檢測(cè)法[7-11]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12]，少有高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法[13]測(cè)定乳制品中乳果糖含量的報(bào)道。

本方法針對(duì)乳制品，通過調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值除去樣品中蛋白質(zhì)，采用氨基色譜柱分離，用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，測(cè)定乳制品中乳果糖的含量，靈敏度高，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單實(shí)用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器設(shè)備

Wa ters2695高效液相色譜儀，A lltech2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,2300TH型超聲波振蕩儀。

1.2 材料試劑

乳果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.000 g/L)，乙腈(色譜純)，實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水，亞鐵氰化鉀水溶液（質(zhì)量濃度為109 g/L），乙酸鋅水溶液（219 g/L）；鹽酸溶液（濃度為1.0mol/L），氫氧化鈉溶液（1.0mol/L），以上試劑除標(biāo)注的外均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Shodex NH 2P-50色譜柱（250 mm×4.6mm，5μm），柱溫為25℃；檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；漂移管溫度為90℃；氣流量為2.2 L/m in；流動(dòng)相A為水；流動(dòng)相B為乙腈；流速為1.0 m L/m in；梯度洗脫程序：0→15m in,10%A線性升至30%A；15→30m in,30%A；30→35m in,30%A勻速降至10%A,保持5m in。

1.3.2 樣品處理

液奶和酸奶：準(zhǔn)確稱量10～20 g到三角瓶中,加入10m L水搖勻。然后用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值到1.7后，放置一分鐘后再調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值到4.5，用水轉(zhuǎn)移到50 m L容量瓶中定容搖勻，濾紙過濾后用0.45μm濾膜過濾,供分析測(cè)定。

1.3.3 定量測(cè)定

標(biāo)樣、樣品測(cè)定的色譜圖如圖1所示。圖1中，峰1分別為1乳果糖。

圖1 乳果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品品色譜

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

關(guān)于糖類檢測(cè)，國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[14-15]推薦的色譜柱是NH2柱，流動(dòng)相為乙腈與水，比例為70∶30。通過改變乙腈與水的比例發(fā)現(xiàn)各種糖的保留時(shí)間會(huì)發(fā)生顯著變化，并且隨著水的比例的增加而保留時(shí)間不斷縮短。經(jīng)過優(yōu)化通過改變乙腈與水的比例，當(dāng)以乙腈與水的比例為75∶25等度洗脫時(shí)，發(fā)現(xiàn)乳果糖和蔗糖二者保留時(shí)間接近，無法完全分離。當(dāng)乙腈與水比例為以80∶20等度洗脫時(shí)，這兩種物質(zhì)分離度有所改善。當(dāng)乙腈與水比例從80∶20漸變到90∶10，發(fā)現(xiàn)二者分離效果較好，但乳果糖保留時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致響應(yīng)小，靈敏度低，通過嘗試乙腈與水比例從90∶10漸變到70∶30，乳果糖、蔗糖和乳糖被洗脫出來，乳果糖與蔗糖達(dá)到基本分離，乳果糖響應(yīng)和靈敏度得到了提高。再維持乙腈與水比例70∶30一段時(shí)間，沖洗色譜柱，保證了樣品測(cè)定的重復(fù)性，縮短整體的分離時(shí)間。所以在保證各組分良好分離的前提下，加快了乙腈上升的速率，縮短了分析時(shí)間，提高了靈敏度，最終的梯度程序?yàn)?.3.1節(jié)所述。

2.2 檢測(cè)器參數(shù)的確定

載氣流速和漂移管溫度是蒸發(fā)光散射檢測(cè)器中可以調(diào)節(jié)的兩個(gè)重要參數(shù)，建立HPLC-ELSD分析方法需要對(duì)這兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在相同的載氣流速下，漂移管溫度從60℃增加，流動(dòng)相逐漸得到充分揮發(fā)，噪聲不斷降低，而乳果糖的響應(yīng)不斷增加，當(dāng)漂移管溫度的溫度為90℃時(shí)信噪比最高，漂移管溫度的溫度進(jìn)一步增加，噪聲大小基本維持不變，而乳果糖的響應(yīng)開始大幅度降低，信噪比就降低了如圖2（a），所以漂移管溫度確定為90℃。在其它條件不變的情況下，載氣流速越小，形成的物質(zhì)粒子半徑越大，對(duì)激光的散射能力越強(qiáng)，相應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)越大。但并不是載氣流速越小越好，因?yàn)楫?dāng)載氣流速太小時(shí)，流動(dòng)相不能完全揮發(fā)，背景噪聲會(huì)增加，信噪比也會(huì)降低。最優(yōu)載氣流速應(yīng)是在可接受噪音的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生最大檢測(cè)響應(yīng)值時(shí)的最低流速。在相同的漂移管溫度下，載氣流速從1.5 L/m in增加，流動(dòng)相逐漸得到充分揮發(fā)，噪聲不斷降低，而乳果糖的響應(yīng)不斷增加，當(dāng)載氣流速為2.2 L/m in時(shí)信噪比達(dá)到最高，載氣流速進(jìn)一步增加，噪聲略有降低，而乳果糖的響應(yīng)開始大幅度下降，信噪比就變小了如圖2（b），所以載氣流速確定為2.2 L/m in。

圖2 OPO信噪比與檢測(cè)器參數(shù)的關(guān)系

2.3 樣品提取條件的確定

由于乳制品中含有較多的蛋白質(zhì)和脂肪，如果不除去蛋白和脂肪，不利于提取分離。由于糖易溶于水，用乙腈或乙醇等有機(jī)試劑沉淀，加入的量少，沉淀效果不好，加入的量多，會(huì)有部分糖析出，都會(huì)給出的結(jié)果帶來影響。加堿或硫酸銅沉淀蛋白，會(huì)導(dǎo)致糖類化合物發(fā)生化學(xué)變化，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。選擇國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[3-4]使用的亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作復(fù)合沉淀劑，可除去樣品中絕大部分蛋白質(zhì)和脂肪，效果要比加乙腈或乙醇等有機(jī)試劑沉淀、加堿或硫酸銅沉淀等其他方法好。但如果亞鐵氰化鉀和乙酸鋅復(fù)合沉淀劑加入的少，蛋白沉淀不完全，會(huì)給提取和凈化帶來困難，影響測(cè)定，加的過多會(huì)造成提取不完全導(dǎo)致被測(cè)物的損失，復(fù)合沉淀劑的濃度和用量不好控制，此外對(duì)色譜柱傷害大，影響色譜柱使用壽命。通過試驗(yàn)，用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值到1.7后，再調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值到4.5，沉淀蛋白效果好，糖類不易析出，提取效果好，沒有外加入大量的鹽有利于蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，回收率較好，準(zhǔn)確度較高。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

散射光的響應(yīng)值與粒子質(zhì)量的關(guān)系為I＝kmb，m表示待測(cè)組分的粒子質(zhì)量和，I表示待測(cè)組分所產(chǎn)生的散射光光強(qiáng)，k,b為常數(shù)。通過使用雙對(duì)數(shù)方法產(chǎn)生線性曲線,即對(duì)待測(cè)組分的濃度和響應(yīng)同時(shí)取對(duì)數(shù),得到線性方程lg I＝b lg m＋lg k。分別配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，在最佳色譜條件下，進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定，得到乳果糖的回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍，并以3倍信噪比時(shí)的進(jìn)樣濃度計(jì)算出了方法的檢出限如表1所示。

表1 乳果糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍和檢出限

2.5 回收率

以同一個(gè)液奶樣品為實(shí)驗(yàn)材料，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液,進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定3次，以平均測(cè)定值計(jì)算回收率，結(jié)果如表2所示。

2.6 方法的精密度

以4個(gè)樣品為實(shí)驗(yàn)材料，稱取樣品后進(jìn)行平行8次重復(fù)性實(shí)驗(yàn),計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。樣品中乳果糖含量和測(cè)定結(jié)果的RSD如表3所示。由此可以看出，測(cè)定結(jié)果的較為穩(wěn)定，方法的重復(fù)性較好。

表2 乳果糖的回收率（n=3）

表3 實(shí)際樣品中乳果糖測(cè)定的精密度率（n=8）

3 結(jié) 論

本文重點(diǎn)研究了樣品的提取條件、色譜分離條件和檢測(cè)參數(shù)的設(shè)定，建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)測(cè)定乳制品中乳果糖的方法。該方法測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，簡(jiǎn)單易操作，適合乳制品中乳果糖的日常監(jiān)測(cè)，可用于復(fù)原乳的鑒定檢測(cè)。

參考文獻(xiàn):

[1]PELLEGRINO A,NON ID I,RESM IN IP.Coupling of lactulose and furosineindices for quality evaluation of sterilized milk[J].International Dairy Journal,1995,5:647-659.

[2]MUANGTHAIP,SAIJANG D,SUTHAVIRISAN S.Determination of lactulose content in heated m ilk samples[J].31st Congresson Science and Technology of Thailand,2005:10,18-20.

[3]宋昆岡.中國(guó)乳制品工業(yè)的十年回顧與展望[J].乳品科技與信息2005,148(17):3-7.

[4]NY/T 939-2016巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定[S].

[5]劉放南,譚力,羅楠.高效液相色譜法檢測(cè)尿乳果糖/甘露醇排出比值及成人正常值[J].腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng),2004,11(4):237-238.

[6]翟平,胡燕,黎海芪.高效液相色譜法檢測(cè)尿樣中甘露醇和乳果糖濃度[J].兒科藥學(xué)雜志,2005,11(2):1-3.

[7]周利,劉菊,鄭婷,等.高效陰離子交換色譜-脈沖安培法檢測(cè)小鼠尿液中的甘露醇、單糖和乳果糖[J].色譜,2010,28(10):984-988.

[8]曾文芳,時(shí)巧翠,陳永欣,等.離子色譜電化學(xué)測(cè)定牛奶中的乳糖和乳果糖[J].食品科學(xué),2006,27(05):205-207.

[9]付曉伶,周榮耀,潘廣文.離子色譜法測(cè)定大腸癌患者尿液中的甘露醇和乳果糖[J].分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào),2012,40(4):608-611.

[10]于博昊,杜一平,謝小波,等.離子色譜法檢測(cè)幼兔尿樣中的乳果糖與甘露醇[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2010,29(3):119-121.

[11]曾文芳,吳龍,楊中喬,等.牛奶中乳糖和乳果糖離子色譜電化學(xué)修飾法測(cè)定[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,18(5):810-812.

[12]胡強(qiáng),徐紅兵,李水軍,等.液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定尿中乳果糖、甘露醇和乳糖含量[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(13):1810-1813.[13]陳丹,姜春燕,馬辰.HPLC-ELSD法測(cè)定尿液中甘露醇和乳果糖濃度[J].感染、炎癥、修復(fù),2007,8(2):79-82.

[14]GB 5009.8-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的測(cè)定[S].

[15]GB 5009.225-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).食品中果聚糖的測(cè)定[S].