沈泓，姜侃，劉鵬鵬，李超，張林爽，王征南

（1.浙江省食品藥品檢驗研究院，杭州310052；2.浙江省產品質量安全檢測研究院，杭州310007；3.浙江方圓檢測集團股份有限公司，杭州310018）

0 引言

維生素B12是人體必需的唯一含有金屬離子的水溶性維生素[1]，以結合態(tài)和游離態(tài)2種形式存在，結合態(tài)又分為結合咕啉蛋白、中間絲狀蛋白IF[2,3]。維生素B12的檢測至今是國際上食品分析的難題之一，首先B12有多種結構形式，如羥鈷胺素、腺苷鈷胺素、甲基鈷胺素、氰基鈷胺素等，其次B12的質量濃度很低[4]。AOAC以及食品安全國家標準GB 4789.14-2010都將微生物法作為維生素B12檢測的首選方法和仲裁方法[5,6]。微生物法由于具有較高的靈敏度和可靠性得到國際權威機構的認可。

本文對維生素B12的微生物比濁法進行優(yōu)化，采用抗生素光度測量儀對嬰兒奶粉、嬰兒營養(yǎng)素、成人高脂奶粉、嬰兒大豆粉4種基質中維生素B12進行實時培養(yǎng)測控，準確捕獲測定時間，建立一種準確、快捷的檢測方法。

1 實驗

1.1 材料與試劑

萊士曼氏乳酸桿菌標準菌株（ATCC 7830），維生素B12標準品，乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基，乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，維生素B12測定用培養(yǎng)基，嬰兒奶粉，嬰兒營養(yǎng)素，成人高脂奶粉，嬰兒大豆粉樣品。

1.2 儀器與設備

抗生素光度測量儀，高壓蒸汽滅菌器，恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 方法

1.3.1 測試用菌液的制備

將萊士曼氏乳酸桿菌活化后，再轉種2～3代，離心棄去培養(yǎng)液，加入生理鹽水，混勻制成測試菌液。以生理鹽水做空白，于550 nm波長下測試菌液的透光率，使其透光率在60%～80%之間。

1.3.2 試樣的處理

稱取無水磷酸氫二鈉1.3 g，無水偏重亞硫酸鈉1.0 g，檸檬酸（含1個結晶水）1.2 g，用100m L水溶解。

精密稱取一定量的樣品，含維生素B12約50～100 ng，用10 m L上述溶液混合后，再加150 m L水，于121℃水解10 m in，冷卻后調pH值至4.5±0.2，再用水定容至250 m L，過濾。取濾液5 m L，加入水20～30 m L，調pH值至6.8±0.2，用水定容至100 m L。臨用前于121℃滅菌5m in后迅速冷卻。

1.3.3 標準曲線的制作

精密量取維生素B12標準品工作液，加水稀釋至含維生素B12質量濃度分別為0，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.10 ng/m L的系列標準品溶液。臨用前于121℃滅菌5 m in后迅速冷卻。取已加入菌液（50μL）的維生素B12測定培養(yǎng)基5 m L至已滅菌的比濁管中，分別加入上述標準品溶液1.0 m L，平行3管，并加滅菌水補充總體積至10m L。

1.3.4 樣品待測液的制作

取已加入菌液（50μL）的維生素B12測定培養(yǎng)基5 m L至已滅菌的比濁管中，分別加入樣品溶液1.0，2.0，3.0，4.0m L，平行三管，并加滅菌水補充總體積至10m L。

1.3.5 培養(yǎng)與測定

置于抗生素光度測量儀中36℃培養(yǎng)，并于550 nm波長實時測定吸光度。

1.3.6 結果計算

試樣中維生素B12的質量分數(shù)（μg/100 g）=標準曲線計算的維生素B12含量（ng）×稀釋倍數(shù)/樣品質量（g）/10。

1.3.7 重復性實驗

取同一份樣品，不同天數(shù)重復測定6次，計算平均值及RSD值。

1.3.8 加標回收實驗

4種基質樣品在第二次實驗時分別加標實驗，加標質量濃度約為本底的50%取整。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

以維生素B12標準品質量濃度作橫坐標，吸光度作縱坐標，二次曲線方法擬合標準曲線。6次實驗標準曲線如圖1所示。由圖1可以看出，B12質量濃度在0.01～0.10 ng/m L范圍內，B12質量濃度與對應吸光度相關性較好，6次實驗相關系數(shù)分別為0.9926，0.9947，0.9974，0.9946，0.9955和0.9970。

圖1 標準曲線

2.2 重復性及加標回收率

重復性實驗結果如表1所示。由表1可以看出4種基質樣品的RSD值分別為6.30%，2.36%，4.30%和3.15%，說明本法的重現(xiàn)性較好。4種基質樣品的B12加標回收率在84.7%～103.9%之間。

表1 重復性實驗結果

3 結果與討論

維生素B12對于萊士曼氏乳酸桿菌（ATCC 7830）的正常生長是必需的，在測定用培養(yǎng)基中供給除維生素B12以外的所有營養(yǎng)成分，則微生物生長產生的透光率會同待測溶液中維生素B12的質量濃度相對應，即可根據(jù)標準曲線間接地測定樣品中維生素B12的質量濃度。

微生物法的優(yōu)勢在于：它是以應用微生物試驗對象為基礎，測得是生物活性含量，更具生物學意義；微生物具有自身的特異性和高度的靈敏性而使測定結果更為準確。AOAC和美國藥典都推薦使用萊士曼氏乳酸桿菌，而英國分析方法協(xié)會主張使用O.malhamensis，Euglena gracilis也可以作為檢驗菌。O.malhamensis對鈷胺素更為專一，結果更接近鈷胺素的臨床活性近似值，但培養(yǎng)時間需要3～4 d，而萊士曼氏乳酸桿菌只需1～2 d。Euglena gracilis需要厭氧條件，更適于血清和血漿的分析[7]。因此本文選擇萊士曼氏乳酸桿菌進行實驗。

運用微生物法檢測維生素B12，其準確度與靈敏度取決于試驗中菌活力、培養(yǎng)基優(yōu)劣、樣品處理方式以及人員操作等因素。并嚴格要求無菌操作，玻璃器皿要嚴格清洗滅菌、200℃干熱2 h，培養(yǎng)基以及樣品處理時降溫過程要迅速，避免顏色生成。微生物的生長過程中會受到競爭和抑制作用，微生物法的標準曲線各個點并不是分布在一條直線上，隨著維生素B12質量分數(shù)的增加吸光度增長趨緩。

在線監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，培養(yǎng)時間在18～20 h后，樣品中的菌種基本結束對數(shù)生長期，可進行測定。本法讀取數(shù)據(jù)時間達到一致，操作步驟簡便，減少了人員誤差，而拉丁方排列培養(yǎng)可減少系統(tǒng)誤差，本研究有利于實驗室微量維生素檢驗的應用。

參考文獻：

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[3]WA TANABE F,ABEK,FUJITA T,et al.Effects of microwave heating on the loss of vitamin B12in foods[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,1998?,46(1):206-210.

[4]崔明，楊大進，魯杰等.VB12檢測技術研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(4):166-171.

[5]AOAC Official Method 986.23 Cobalam in(Vitam in B12Activity)in Milk-Based Infant Formula Turbid imetric Method[S].

[6]GB 5413.14-2010.食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定[S].

[7]張玉杰，呂為群，殷曉紅.奶基嬰幼兒食品中維生素B12活性測定—微生物分析法[J].生物技術,1993(6):39-43.