吳遙西，李浩勇，周治彥，陳金火，李琦，馬哲，金應霞，梁培育

（1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，海南 ?？?570102；2.武漢大學人民醫(yī)院 泌尿外科，湖北 武漢 430060；3.武漢大學人民醫(yī)院 中心實驗室，湖北 武漢 430060）

膀胱癌是最常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤[1]，尋找有效的治療靶點是研究熱點之一。已有研究證明，膀胱癌組織細胞能表達免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG），并與細胞生長和凋亡有關[2-6]。CHEN等[7]發(fā)現(xiàn)，在多種癌細胞中，IGHG1基因表達與腫瘤來源的IgG呈正相關。為明確腫瘤來源IgG對膀胱癌細胞功能學的影響，本研究采用慢病毒載體RNA干擾（RNA interference，RNAi）方法沉默膀胱癌EJ細胞的IGHG1基因，降低腫瘤來源IgG的表達，探究EJ細胞增殖、凋亡及遷移的改變。

1　材料與方法

1.1　細胞與試劑

EJ細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）。胎牛血清、RPMI 1640、青霉素鏈霉素溶液和Trizol?Reagent購自美國Invitrogen公司，RIPA裂解液（強）、PMSF購自上海威奧生物科技有限公司，聚丙烯酰胺凝膠（上海威奧公司），PhosSTOP（美國F.Hoffmann-La Roche公司），小鼠抗人IgG重鏈單克隆抗體（英國Abcam公司），兔抗人Caspase-3單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司），小鼠抗人GAPDH單克隆抗體（北京康為世紀公司），熒光二抗（美國Li-COR公司），Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司），CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司），BD PharmingenTMPE Annexin V Apoptosis Detection試劑盒（美國BD Biosciences公司），LV-IGHG1-RNAi和陰性對照序列（negative scrambled，NC）慢病毒、Polybrene由上海吉凱基因化學技術有限公司構建。其余試劑均為市售分析純產品。

1.2　主要儀器

Applied Biosystems by Life Technologies 7500型實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 系 統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司），Licor Odyssey雙通道紅外成像系統(tǒng)（美國Li-COR公司），BD FACSCalibur流式細胞儀（美國BD Biosciences公司），Perkin Elmer Victor 31420 Multilabel Counter酶標儀（美國PerkinElmer公司）。

1.3　細胞培養(yǎng)

未轉染的EJ細胞、已穩(wěn)定轉染LV-IGHG1-RNAi的shIGHG1-EJ細胞，以及穩(wěn)定轉染NC基因的NC-EJ細胞用含10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)基，放置于37℃、5%二氧化碳CO2環(huán)境中培養(yǎng)。實驗用細胞培養(yǎng)至70%～80%細胞密度、處于增殖期的細胞，用胰酶消化后收集細胞進行相關實驗。構建穩(wěn)定沉默IGHG1基因的EJ細胞（shIGHG1-EJ細胞）作為實驗組；將NC慢病毒載體感染EJ細胞，構建穩(wěn)定轉染NC序列的NC-EJ細胞作為陰性對照組；未轉染膀胱癌EJ細胞作為空白對照組。

1.4　方法

1.4.1慢病毒的構建GenBank查獲人IGHG1（Gene ID：3500）mRNA序列，設計19 bp的IGHG1-RNAi正向引物：5’-AGTGCAAGGTCTCCAACAA-3’，反向引物：5’-TTGTTGGAGACCTTGCACT-3’；NC正向引物 ：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反向引物 ：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。LV-IGHG1-RNAi和NC慢病毒由上海吉凱基因化學技術有限公司制備，慢病毒載體（GV248）由熒光標記包裝，病毒滴度3×108TU/ml。

1.4.2構建穩(wěn)定轉染的shIGHG1-EJ和NC-EJ細胞將EJ細胞以5×104個/孔接種于6孔板，分為實驗組和陰性對照組，細胞貼壁后將20μl/孔LVIGHG1-RNAi或NC慢病毒溶液、0.5μl/孔Polybrene分別加入實驗組和陰性對照組轉染EJ細胞，轉染18 h后更換1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)轉染至72 h，觀察綠色螢光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達并計算感染率。

1.4.3qRT-PCR采用qRT-PCR檢測細胞IGHG1的表達。設計GAPDH和IgG引物。GAPDH正向引物：5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGC-3’，反向引物：5’-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’；IgG正向引物：5’-TCCAAGAGGAAACCGTAAC-3’，反向引物：5’-GACACTGGCAGAGGTGATT-3’。 用 Trizol提 取shIGHG1-EJ、NC-EJ和EJ細胞的總RNA，按Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒說明書操作步驟逆轉錄cDNA。按SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒說明書，加入相應引物的反應體系，用qRT-PCR系統(tǒng)檢測 Ct值。使用 2-ΔΔCt法分析 shIGHG1-EJ、NC-EJ和EJ細胞IGHG1 mRNA的相對表達量，不同時間重復3次。

1.4.4Western blot檢測采用 Western blot檢測IgG、Caspase-3和Caspase-3剪切片段蛋白的表達。消化并收集shIGHG1-EJ、NC-EJ和EJ細胞，加入RIPA、PhosSTOP和PMSF，按100∶4∶1比例配制蛋白裂解工作液，冰上提取總蛋白，檢測蛋白濃度，取100μg蛋白樣品經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉膜、封閉2 h，加入相應稀釋倍數的一抗4℃過夜，洗膜后加入1∶15 000稀釋倍數的對應熒光二抗室溫孵育2 h。用雙通道紅外成像系統(tǒng)檢測雜交信號，用Image J軟件檢測IgGγ和GAPDH的相對表達量，實驗重復3次。

1.4.5CCK-8法采用CCK-8法檢測細胞增殖功能。消化并收集shIGHG1-EJ、NC-EJ和EJ細胞，以5×103個/孔接種于96孔板中培養(yǎng)，分別于0、6、12、24和 48 h加 入 10μl/孔 CCK-8試 劑，置于37℃恒溫箱反應3 h后，用酶標儀檢測各孔在450～490 nm處光密度（optical density，OD）值，以平均OD值表示細胞增殖數量，實驗重復3次。

1.4.6流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）采用FCM檢測細胞凋亡。消化并收集shIGHG1-EJ、NC-EJ和EJ細胞，以1×105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)。貼壁后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶消化后收集細胞，按BD PharmingenTMPE Annexin V Apoptosis Detection試劑盒說明書操作，加入100μl 1×Bingding Buffer重懸細胞，并加入 Annexin-V-PE和7-AAD各5μl，室溫避光15 min后再加入400μl 1×Bingding Buffer，并使用流式細胞儀檢測并分析細胞凋亡，實驗重復3次。

1.4.7細胞的遷移功能測定將shIGHG1-EJ、NC-EJ和EJ細胞接種于6孔板中，待細胞生長＞80%時在中央劃痕，用PBS洗去劃下細胞后,在RPMI 1640無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用倒置顯微鏡觀察0、8和24 h細胞的遷移情況并拍照，用Image J軟件對遷移細胞進行分析，實驗重復3次。

1.5　統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1　驗證穩(wěn)定轉染的shIGHG1-EJ和NC-EJ細胞

EJ細胞感染LV-IGHG1-RNAi或NC慢病毒72 h后，熒光顯微鏡下觀察，有綠色熒光蛋白GFP表達的細胞即為成功轉染的shIGHG1-EJ細胞（實驗組）和NC-EJ細胞（陰性對照組），實驗組的轉染率為（76.667±0.042）%，陰性對照組為（75.333±0.055）%（見圖1A）。shIGHG1-EJ、NC-EJ和 EJ細 胞 的IGHG1 mRNA表達量比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=630.167，P=0.000），shIGHG1-EJ細胞為EJ細胞的（2.473±0.901）%，NC-EJ細胞 為 EJ細 胞 的（85.631±7.875）%，shIGHG1-EJ細胞IGHG1 mRNA表達量降低（見圖1B）。shIGHG1-EJ、NC-EJ和EJ細胞的IgGγ蛋白表達量分 別 為（2.842±0.013）%、（18.023±0.023）% 和（18.209±0.121）%，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=30 603.431，P=0.000），shIGHG1-EJ細胞較 EJ細胞降低（P＜0.05）；NC-EJ細胞與 EJ細胞比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見圖1C）。

2.2　細胞增殖

比 較 shIGHG1-EJ、NC-EJ和 EJ細胞在0、6、12、24和48 h的OD值，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的OD值有差別（F=11766.959，P=0.000）；② 3組 的 OD值 有差別（F=59.646，P=0.000），實驗組的OD值較低，提示shIGHG1-EJ細胞增殖受抑制，沉默IGHG1基因抑制細胞增殖；③各組的OD值變化趨勢有差別（F=10.118，P=0.000）。見表1和圖2。

圖1　穩(wěn)定轉染的shIGHG1-EJ和NC-EJ細胞

表1　3組不同時間時點OD值比較　（±s）

表1　3組不同時間時點OD值比較?。ā纒）

?

圖2　3組不同時間點OD值變化趨勢

表2　3組細胞凋亡率比較?。?，±s）

表2　3組細胞凋亡率比較　（%，±s）

?

2.3　細胞凋亡

3組晚期凋亡率（upper right，UR）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；3組早期凋亡率（lower right，LR）及總凋亡率（LR+UR）比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗組細胞凋亡率較空白對照組高，表現(xiàn)為細胞早期凋亡，提示沉默IGHG1基因促進細胞凋亡。陰性對照組與空白對照組凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示轉染攜帶NC慢病毒對細胞凋亡無明顯影響（見表2和圖3）。Western blot檢測結果表明，實驗組出現(xiàn)明顯的Caspase-3剪切片段，提示沉默IGHG1基因誘導細胞凋亡增多（見圖4）。

2.4　細胞遷移能力

空白對照組、陰性對照組、實驗組的24 h遷移細胞數分別為（694±14）、（683±13）和（246±65）個，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=120.316，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，實驗組遷移細胞數僅為空白對照組的36%（P＜0.05），提示沉默IGHG1基因抑制細胞遷移；陰性對照組與空白對照組24 h細胞遷移數比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示轉染攜帶NC慢病毒對細胞凋亡無明顯影響。見圖5。

圖3　細胞凋亡情況

圖4　Caspase-3和Caspase-3剪切片段蛋白的表達

圖5　細胞遷移能力

3　討論

最新統(tǒng)計調查顯示，膀胱癌居我國男性腫瘤發(fā)病率的第7位[8]。針對膀胱癌的診斷、治療和特異性靶向治療一直是熱門研究。有研究表明，免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）能表達于多種上皮來源的腫瘤細胞（肝癌、肺癌、乳腺癌和直腸癌等）及部分正常的上皮細胞（肺組織）[7-10]。WAN等[11]近期研究發(fā)現(xiàn)，不僅在人胰腺癌細胞中可以檢測到IgG的表達，而且胰腺表達IgG還與糖尿病的發(fā)病有關；JIANG等[9]在肺癌組織中也有相同發(fā)現(xiàn)。上述研究均表明，腫瘤來源的IgG對癌細胞的增殖和生長具有一定促進作用，在正常細胞中，IgG的表達增多可能是導致疾病發(fā)生、發(fā)展的因素之一。

CHEN等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在多種癌細胞系中均能檢測到IGHG1恒定區(qū)基因和腫瘤來源的IgG蛋白表達，Igγ1鏈恒定區(qū)能被腫瘤細胞的IGHG1基因編碼并表達。可以認為IGHG1編碼IgGγ1鏈恒定區(qū)與腫瘤來源IgG蛋白的合成有直接關系。PAN等[12]研究報道，在抑制IGHG1基因后，前列腺癌細胞的增殖受抑制，同時前列腺癌細胞凋亡增加。因此，在腫瘤細胞中，IGHG1編碼IgGγ1鏈恒定區(qū)，參與IgG蛋白的表達，從而促進腫瘤的增殖，抑制細胞凋亡。

本研究表明，針對EJ細胞進行IGHG1基因特異性沉默后，構建了穩(wěn)定沉默IGHG1基因的shIGHG1-EJ細胞作為實驗組，以及穩(wěn)定轉染NC基因序列的NC-EJ細胞作為陰性對照組。另外，將未轉染的膀胱癌EJ細胞作為空白對照組。qRT-PCR和Western blot檢測結果表明，shIGHG1-EJ細胞的IgG mRNA和蛋白表達水平低于轉染NC的NC-EJ細胞和野生型EJ細胞株。CCK-8法結果表明，與后2種細胞相比，shIGHG1-EJ細胞的48 h細胞增殖能力降低；細胞劃痕實驗表明，24 h細胞遷移能力也降低。同時FCM結果表明，IGHG1基因沉默后促進EJ細胞的凋亡，筆者通過Caspase-3及其剪切片段驗證了細胞的凋亡?？梢哉J為這些膀胱癌EJ細胞功能學的改變可能與腫瘤來源的IgG表達降低有關。

IgG可以在多種細胞中檢測到。在泌尿系統(tǒng)腫瘤中，膀胱癌組織和細胞的IgG表達高于正常尿路上皮組織。筆者通過針對IGHG1基因進行特異性沉默后，檢測膀胱癌EJ細胞功能學的改變，發(fā)現(xiàn)腫瘤來源IgG表達與EJ細胞功能學具有明顯的相關性，與細胞凋亡呈負相關，因此，筆者推測IgG可以成為膀胱癌靶向治療的一個有效靶點。針對腫瘤來源的IgG或IGHG1基因靶向治療可以促進腫瘤細胞的凋亡。

在生理狀態(tài)下，活化誘導胞嘧啶核苷脫氨酶（activated—induced cytidine deaminase，AID）是一種由B細胞表達的誘導基因高度突變（somatic hypermutation，SHM）和免疫球蛋白基因的類別轉換重組蛋白。而重組活化基因-1（recombination activating gene，RAG-1）和重組活化基因-2（RAG-2）則是免疫球蛋白進行Ig VH基因重排和修飾表達的重要酶，在AID作用的下游增強免疫系統(tǒng)抗體表達的多樣性[13]，RAG-1和RAG-2是合成IgG的關鍵酶，因此AID的高表達刺激RAG-1和RAG-2表達活躍，可能是導致腫瘤細胞IgG表達增多的因素之一。

CASCALHO[14]研究發(fā)現(xiàn)，AID是一個與基因誘導突變相關的酶，涉及DNA/RNA編輯的酶，其能將胞嘧啶轉化成尿嘧啶，通過修改靶基因的序列，從而產生對人體各種有利的作用和效應。生理狀態(tài)下為維持內環(huán)境和遺傳信息的穩(wěn)定，細胞具備基因突變和修復核苷酸序列改變的體系，從而避免所謂“體細胞突變”，如SHM，產生有害的單個核苷酸改變。但是癌細胞常由基因突變導致，同時癌細胞在轉化過程中也常獲得大量的體細胞突變，此時在AID的過度表達下，有可能會影響基因表達而產生有害的突變；腫瘤細胞中IgG的過表達也是其影響之一[15]。

綜上所述，AID作為與IgG表達有關的上游蛋白酶，很可能是引起腫瘤細胞IgG表達增加和促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的因素之一。接下來，一方面可以針對膀胱尿路上皮癌細胞IGHG1基因抑制和細胞凋亡的相關性進行進一步研究，從膀胱癌細胞IGHG1基因沉默和化療藥物的聯(lián)合應用，進一步探討該位點在抗腫瘤治療中的可行性。另一方面，從AID開始探究腫瘤細胞中IgG表達升高的機制，以及從下游通路探尋其可能促進腫瘤細胞生長，抑制腫瘤細胞凋亡的機制，為尿路上皮腫瘤的靶向治療提供更多依據。

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