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1 氨基酸含量測定方法建立

1.1 氨基酸測定方法來源

參照國外藥典方法及文獻所述氨基酸檢測方法，初步確定使用異硫氰酸苯酯柱前衍生化方法，作為氨基酸含量測定方法。以PITC試劑作為柱前衍生劑，用反相色譜進行氨基酸的分離測定。其分析原理是當氨基酸與PITC偶合反應后衍生成為PTC-氨基酸，衍生反應見下圖。

圖1 氨基酸與PITC偶合反應

由于在原來的氨基酸結構上引入了苯環(huán)，使得氨基酸的極性大為降低，用紫外檢測器定量測定PTC-氨基酸靈敏度提高，并且衍生副產物對測定無干擾，PTC-氨基酸結構穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。故初步確定細化研究異硫氰酸苯酯柱前衍生化法，建立復方氨基酸顆粒（14AA）含量測定方法。

1.2 儀器及試劑

儀器：waters2696液相色譜儀；waters2996DAD檢測器；ESJ182-4電子天平；PHS-25型酸度計。

對照品：異亮氨酸、亮氨酸、鹽酸賴氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、精氨酸（藥用級原料)

試劑：異硫氰酸苯酯（阿拉丁）；乙腈（美國天地）；三乙胺（南京化學試劑廠）；鹽酸（南京化學試劑廠）；無水乙酸鈉（國藥集團）。

樣品：復方氨基酸顆粒（14AA）來源：瑞年百斯特制藥有限公司。

1.3 色譜條件

2008年中國藥品生物制品檢定所程顯隆在《藥物分析》雜志中，發(fā)表文章“柱前衍生化HPLC法同時測定阿膠中4種主要氨基酸的含量”，最終選用十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑；以0.1mol/L醋酸鈉溶液-乙腈（93：7）為流動相 A，以乙腈 -水（4：1）為流動相B，進樣量2μl；流速為每分鐘1.0ml；檢測波長為254nm；柱溫為37℃。梯度條件為0-12分鐘，流動相B由0%升至7%，12-30分鐘，流動相B由7%升至12%，30-35分鐘，流動相B由12%升至17%，35-54分鐘，流動相B由17%升至32%，54-55分鐘，流動相B由32%升至100%，55-60分鐘，流動相B保持100%不變，60-61分鐘，流動相B保持100%降為0%，61-70分鐘，流動相B保持0%不變。

1.4 供試品、對照品溶液、衍生試劑的配制及各氨基酸的出峰順序

（1）衍生試劑的配制。

①1mol/L三乙胺乙腈溶液：取三乙胺14ml，加乙腈稀釋至100ml，混勻。

②0.2mol/L異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液：取PITC2.4ml，加乙腈稀釋至100ml，混勻

（2）供試品溶液制備。精密稱取細粉適量（約相當于異亮氨酸56.3mg），置100ml量瓶中，加0.1mol/L鹽酸適量，置60℃水浴中加熱20分鐘，放冷，用0.1mol/L鹽酸稀釋至刻度，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液200μl，加入0.2mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液100μl，1mol/L三乙胺乙腈溶液100μl，搖勻，40℃放置1小時，作為供試品溶液。

（3）對照品溶液制備。分別稱取各氨基酸對照品，置100ml量瓶中，加0.1mol/L鹽酸適量，振搖使完全溶解，用0.1mol/L鹽酸稀釋至刻度，搖勻，精密量取200μl，加入0.2mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液 100μl，1mol/L三乙胺乙腈溶液100μl，搖勻，40℃放置1小時，作為對照溶液。

（4）氨基酸的出峰順序。氨基酸的出峰順序為絲氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、鹽酸賴氨酸。

2 復方氨基酸顆粒含量測定方法驗證

2.1 線性

按單制劑處方精密稱取各氨基酸原料，置100ml量瓶中，加入適量0.1mol/L鹽酸，60℃水浴中加熱20分鐘，放冷，用0.1mol/L鹽酸定容到刻度，分取 2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml上述溶液，置50ml量瓶中，0.1M鹽酸稀釋定容到刻度。精密量取上述溶液各200μl，加入 0.2mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液 100μl，1mol/L三乙胺乙腈溶液100μl，搖勻，40℃放置1小時。分別注入液相色譜儀，記錄峰面積。結果：各氨基酸濃度與峰面積線性關系良好。

2.2 溶液的穩(wěn)定性試驗

取復方氨基酸顆粒（14AA）樣品，制成含量測定供試液，分別于0、1、2、4、6、8小時取樣，測定峰面積，計算RSD值。結果：8h內峰面積的RSD小于2%，說明供試液的溶液穩(wěn)定性好。

2.3 回收率試驗

取9個100ml容量瓶，標識1-9號，各分別準確稱取本品單制劑十分之一處方量輔料。在1-3號量瓶中分別加入單制劑8%處方量各氨基酸；4-6號量瓶中分別加入單制劑10%處方量各氨基酸；7-9號量瓶中分別加入單制劑12%處方量各氨基酸。0.1N鹽酸稀釋至刻度，振搖使其充分溶解，過濾，取續(xù)濾液按上述檢測方法測定含量，折算加入量，計算回收率。

結果：各氨基酸回收率在98%-101%之間。確定的復方氨基酸顆粒（14AA）含量測定法準確度好。

3 結語

1.通過此方法所測氨基酸的組分濃度與峰面積有良好的線性,回收率為98%-101%。

2.采用PITC柱前衍生HPLC法，具有操作簡便易行，準確度高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點。

3.衍生后剩余的對氨基酸的測定無干擾，是一種理想的分析氨基酸的方法。