邵彪 周小蘭 王琳琳 陳剛

摘 要：為改善產(chǎn)品品質(zhì)，肉制品加工過程中常常添加植物源性成分，當(dāng)前轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的商品化及其在市場上的廣泛流通導(dǎo)致肉制品中被帶入植源性轉(zhuǎn)基因成分的風(fēng)險增加。以轉(zhuǎn)基因植物中常涉及的調(diào)控元件CaMV 35S啟動子、NOS終止子以及標(biāo)記基因NPTⅡ?yàn)闄z測目標(biāo)，設(shè)計相應(yīng)的引物和Taq man探針，利用載體pRⅠ 101-AN DNA為模板，通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)，建立肉制品中植源性轉(zhuǎn)基因成分的單重和多重?zé)晒舛烤酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法。通過比較分析，考察多重?zé)晒舛縋CR檢測方法的靈敏性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性，結(jié)果表明，多重?zé)晒舛縋CR檢測方法靈敏度高、重復(fù)性好且與單重體系的檢測結(jié)果具有很好的一致性。

關(guān)鍵詞：多重?zé)晒舛縋CR；肉制品；植源性轉(zhuǎn)基因成分

Development of a Multiplex Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction Assay for Detecting

Added Genetically Modified Ingredients Derived from Plants in Meat Products

SHAO Biao1， ZHOU Xiaolan2， WANG Linlin1， CHEN Gang1，*

（1.Nantong Products Quality Supervision and Inspection Institute， Nantong 226011， China；

2.Analysis and Testing Center， Nantong University， Nantong 226019， China）

Abstract： Plant-derived components are often added to meat products during processing to improve their quality. The commercialization and wide circulation in the market of genetically modified crops bring increasing risk of introducing genetically modified components into meat products. In this study， a multiplex fluorescence quantitative polymerase chain reaction （PCR） assay was described for detecting added genetically modified ingredient derived from plants in meat products. Specific primers and Taq man probes targeting the CaMV 35S promoter， NOS terminator and neomycin phosphotransferase Ⅱ （nptⅡ） marker gene were designed and the pRⅠ 101-AN DNA vector was used as template. The sensitivity， repeatability and accuracy of the multiplex PCR assay were confirmed by comparison with traditional PCR. Consistent results were obtained using the two methods.

Keywords： multiplex fluorescence quantitative polymerase chain reaction； meat products； genetically modified ingredient derived from plants

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201801007

中圖分類號：TS251.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2018）01-0041-05

引文格式：

邵彪， 周小蘭， 王琳琳， 等. 肉制品中植源性轉(zhuǎn)基因成分多重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立[J]. 肉類研究， 2018， 32（1）： 41-45. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201801007. http：//www.rlyj.pub

SHAO Biao， ZHOU Xiaolan， WANG Linlin， et al. Development of a multiplex fluorescence quantitative polymerase chain reaction assay for detecting added genetically modified ingredients derived from plants in meat products[J]. Meat Research， 2018， 32（1）： 41-45. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201801007. http：//www.rlyj.pub

肉制品因其獨(dú)特的風(fēng)味深受廣大消費(fèi)者的喜愛，是人們?nèi)粘ｏ嬍车闹匾M成部分。隨著經(jīng)濟(jì)的大幅增長和人民生活水平的持續(xù)提高，我國肉制品產(chǎn)量和消費(fèi)量均居世界前列。在現(xiàn)代肉制品加工過程中，為改善肉制品的品質(zhì)、優(yōu)化產(chǎn)品質(zhì)量、確保營養(yǎng)均衡，植物源性成分，如植物蛋白[1-2]、淀粉[3-4]、膳食纖維[5-6]、食用膠[7-8]、植物油以及各種調(diào)味品等被運(yùn)用到肉制品加工中。

近20多年，轉(zhuǎn)基因作物隨著基因工程技術(shù)的成熟而迅速發(fā)展，截至2016年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積累計達(dá)21 億hm2[9]，我國轉(zhuǎn)基因植物種植面積也在逐年遞增[10-11]。目前，在全世界范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)基因大豆、水稻、玉米、油菜籽、甜菜、水果、甜椒、西紅柿和土豆等產(chǎn)品在市場上大量流通[12-17]。隨著轉(zhuǎn)基因植物的大規(guī)模商品化，多種轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于食品制造業(yè)，因此，在肉制品加工過程中添加植物源成分的同時，轉(zhuǎn)基因成分會間接地、不可避免地滲入到肉制品領(lǐng)域，這已引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[18-20]。

目前，針對轉(zhuǎn)基因成分的檢測，基于DNA的檢測無疑是最為有效的手段，常用的方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、多重PCR、熒光定量PCR以及多重?zé)晒舛縋CR等[21-24]。然而肉制品作為深加工產(chǎn)品，往往需要經(jīng)過復(fù)雜的加工程序，在此過程中，DNA會受到物理、化學(xué)或酶因子等因素的影響，遭到不同程度的破壞，給PCR和熒光定量PCR等單一檢測對象的方法帶來很大的挑戰(zhàn)和風(fēng)險。若檢測目標(biāo)DNA被破壞，就會產(chǎn)生假陰性現(xiàn)象。多重?zé)晒舛縋CR將基于DNA的檢測技術(shù)推向更高的臺階，它是在熒光定量PCR的基礎(chǔ)上，通過使用多對引物和相應(yīng)的探針，實(shí)現(xiàn)在同一個反應(yīng)體系中對多個目標(biāo)序列進(jìn)行同時檢測[25]。CaMV 35S啟動子、NOS終止子以及標(biāo)記基因NPTⅡ是轉(zhuǎn)基因工程中常用的調(diào)控元件，也是轉(zhuǎn)基因檢測常用的檢測對象[26-30]。本研究擬以CaMV 35S啟動子、NOS終止子以及標(biāo)記基因NPTⅡ特異片段序列為檢測目標(biāo)，旨在建立肉制品中植源性轉(zhuǎn)基因成分的多重?zé)晒舛縋CR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆、大米、面粉、生鮮肉和肉制品均購于超市。

植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pRⅠ 101-AN DNA（其結(jié)構(gòu)中含有CaMV 35S啟動子、NOS終止子和標(biāo)記基因NPTⅡ）、Premix Ex Taq?（Perfect Real Time） 大連TaKaRa公司；DNA Marker Ⅰ、2×Taq PCR MasterMi、DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司；E.Z.N.A. Gel Extraction Kit（V-spin） 美國Omega公司；熒光定量PCR八連管（平蓋） 美國Axygen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Stratagene Mx 3000P實(shí)時熒光定量PCR儀 美國Agilent公司；MG96G梯度型PCR儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；CF15RX離心機(jī) 日本Hitachi公司；Eppendorf Research? Plus微量移液器 德國Eppendorf公司；Power Pac Basic電泳儀、Mini-Sub Cell GT電泳槽 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和熒光探針

以轉(zhuǎn)基因植物常用的調(diào)控元件CaMV 35S啟動子、NOS終止子以及標(biāo)記基因NPTⅡ?yàn)闄z測對象，分別選取其特異片段序列為檢測目標(biāo)[26-30]。借助Oligo 6及Primer Premier等引物分析軟件設(shè)計相應(yīng)的上、下游引物及熒光探針，并委托TaKaRa公司合成，對應(yīng)的探針5端分別用熒光試劑標(biāo)記，3端用熒光淬滅劑標(biāo)記。所設(shè)計的引物和探針如表1所示。

1.3.2 樣品DNA的提取

大豆、大米和面粉樣品：用粉碎機(jī)磨成粉末狀，并過80 目篩，按照植物細(xì)胞組織基因組DNA提取試劑盒方法提取樣品DNA。

生鮮肉、肉制品樣品：經(jīng)剪碎或研磨、均質(zhì)后，按照組織基因組DNA提取試劑盒方法提取樣品DNA。

1.3.3 PCR反應(yīng)體系與參數(shù)

以載體pRⅠ 101-AN DNA為模板，將其在4 ℃、10 000 r/min條件下離心2 min，棄去上清液，沉淀重新溶解到1 mL無菌水中，分別利用設(shè)計出的引物擴(kuò)增目標(biāo)基因片段。反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 25 μL、上下游引物（10 μmol/L）各2 μL、模板DNA 4 μL，加水至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.3.4 核酸電泳

PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行1.8%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，時間45 min。電泳結(jié)束后，用溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色10 min。

1.3.5 單重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系與參數(shù)

通過比較、優(yōu)化體系組成和退火溫度，最終確定單重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系為25 μL，體系組成：Premix Ex Taq?（Perfect Real Time）12.5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、探針0.5 μL、模板DNA 2 μL，加水至25 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃變性90 s，以95 ℃、5 s，58 ℃、30s，72 ℃、30 s擴(kuò)增40 個循環(huán)，在58 ℃運(yùn)行程序結(jié)束時開始收集熒光信號。

1.3.6 多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系與參數(shù)

通過比較、優(yōu)化體系組成和退火溫度，最終確定多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系為50 μL，體系組成：Premix Ex Taq?（Perfect Real Time）25 μL、上下游共計6 個引物（10 μmol/L）各1 μL、探針0.5 μL、模板DNA 2 μL，加水至50 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃變性90 s，以95 ℃、5 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s擴(kuò)增40 個循環(huán)，在58 ℃運(yùn)行程序結(jié)束時開始收集熒光信號。

1.3.7 特異性分析

分別以非轉(zhuǎn)基因大豆、大米及面粉的基因組DNA作為模板，以載體pRⅠ 101-AN DNA作為陽性對照模板，檢驗(yàn)本研究所設(shè)計的引物和探針的特異性。

1.3.8 靈敏度實(shí)驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將載體pRⅠ 101-AN DNA標(biāo)準(zhǔn)模板按10 倍梯度稀釋，分別用本研究建立的熒光定量PCR方法檢測體系進(jìn)行檢測，考察檢測下限，根據(jù)循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值對方法的靈敏度進(jìn)行評價。同時，根據(jù)各模板的拷貝數(shù)和相應(yīng)的Ct值，建立熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.9 多重?zé)晒舛縋CR的重復(fù)性

將同一濃度的混合模板利用本研究所建立的多重?zé)晒舛縋CR檢測方法進(jìn)行3 次分析，比較擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.10 多重?zé)晒舛縋CR與單重?zé)晒舛縋CR的準(zhǔn)確性比較

分別用多重?zé)晒舛縋CR與單重?zé)晒舛縋CR檢測方法對相同樣品進(jìn)行分析檢測，比較結(jié)果的一致性，考察多重?zé)晒舛縋CR方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)片段驗(yàn)證

泳道1. DNA Marker Ⅰ（DL100）；泳道2～4. 分別為CaMV 35S啟動子、NOS終止子和標(biāo)記基因NPTⅡ擴(kuò)增的目標(biāo)片段。

由圖1可知，3 種目標(biāo)片段的1.8%瓊脂糖凝膠電泳圖譜表明，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，所擴(kuò)增片段大小均與目標(biāo)相符。

2.2 單重?zé)晒舛縋CR檢測方法分析

2.2.1 靈敏度實(shí)驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究所建立的各方法靈敏度基本能達(dá)到1 pg。

以各標(biāo)準(zhǔn)模板拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2可知，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2均為0.999，表明各標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好。

2.2.2 特異性實(shí)驗(yàn)

本研究所設(shè)計的引物和探針的熒光定量PCR分析結(jié)果表明，載體pRⅠ 101-AN DNA標(biāo)準(zhǔn)模板有典型的熒光擴(kuò)增曲線，而非轉(zhuǎn)基因大米、大豆與空白對照及陰性對照的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，無熒光擴(kuò)增曲線，這表明本研究所設(shè)計的引物和探針具有特異性。

2.3 多重?zé)晒舛縋CR檢測方法分析

2.3.1 擴(kuò)增曲線

3 條橫線為熒光閾值，儀器設(shè)置為3～15 個循環(huán)的熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10 倍。下同。

在同一反應(yīng)體系下，以植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體

pRⅠ 101-AN DNA為模板，加入不同的引物和探針進(jìn)行分析。由圖2可知，CaMV 35S、NOS和NPTⅡ片段可以檢測到相應(yīng)的熒光信號，而空白對照和陰性對照實(shí)驗(yàn)無熒光擴(kuò)增曲線。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用多重?zé)晒舛縋CR體系，分別加入與各單重?zé)晒舛縋CR相同的模板和探針，在同一體系下同時進(jìn)行測試。

由圖3可知，相同模板條件下，多重?zé)晒舛縋CR與單重?zé)晒舛縋CR的測定結(jié)果有很好的一致性，而空白對照和陰性對照實(shí)驗(yàn)無熒光擴(kuò)增曲線。根據(jù)拷貝數(shù)和Ct值建立的針對CaMV 35S啟動子檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.152 lgx+40.190（R2=0.999）；NOS終止子檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-2.983 lgx+39.660（R2=0.998）；標(biāo)記基因NPTⅡ檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-2.967 lgx+39.740（R2=0.999），均具有良好的線性關(guān)系。

2.3.3 重復(fù)性分析

由圖4可知，采用已建立的方法對同一濃度的模板DNA進(jìn)行3 次重復(fù)測定，所得擴(kuò)增曲線基本吻合，因此本研究建立的多重?zé)晒舛縋CR方法有很好的可重復(fù)性，測定結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2.4 多重?zé)晒舛縋CR與單重?zé)晒舛縋CR檢測結(jié)果的比較

利用單重?zé)晒舛縋CR檢測CaMV 35S啟動子、NOS終止子和標(biāo)記基因NPTⅡ的方法已較為成熟，并形成了檢測標(biāo)準(zhǔn)。為考察本研究所建立的多重?zé)晒舛縋CR檢測方法的可行性，將人工污染的同一種肉制品樣品隨機(jī)編號，分別用多重?zé)晒舛縋CR和單重?zé)晒舛縋CR方法進(jìn)行檢測。由表3可知，2 種方法所得到的Ct值基本一致，表明本研究所建立的多重?zé)晒舛縋CR檢測方法具有良好的可靠性。

3 結(jié) 論

實(shí)時熒光定量PCR檢測方法具有快速、特異、靈敏等優(yōu)越性[31-32]，本研究圍繞肉制品中植物源性轉(zhuǎn)基因成分的檢測分別建立單重?zé)晒舛縋CR和多重?zé)晒舛縋CR方法，結(jié)果表明，2 種方法具有相似的靈敏度，在樣品測定中顯示出很好的一致性。因此，應(yīng)用多重?zé)晒舛縋CR同時對多個基因靶序列進(jìn)行檢測是可行的。這可以很好地解決肉制品經(jīng)過復(fù)雜加工過程后DNA遭到破壞帶來的問題，同時也在一定程度上減少了檢測成本，并且使實(shí)驗(yàn)操作更加便捷。

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