李儒仁 沈瑞 榮良燕 林世文 張鵬 葉盛德 勵建榮

摘 要：為延長冷鮮牛肉的貨架期，保證其貯藏期間的食用品質及安全性，采用單因素試驗與正交試驗篩選一組復配生物保鮮劑（乳酸鏈球菌素、納他霉素和ε-聚賴氨酸），并研究其對冷鮮牛肉的保鮮效果。結果表明：復配生物保鮮劑中3 種保鮮劑的最佳配比為乳酸鏈球菌素2.5 g/L、納他霉素1.5 g/L、ε-聚賴氨酸3.0 g/L；冷鮮牛肉在（4±1） ℃條件下貯藏8 d后，其揮發(fā)性鹽基氮值為19.84 mgN/100 g，屬于二級鮮肉；菌落總數(shù)較對照組降低2 個數(shù)量級，表明復配生物保鮮劑能夠有效抑制腐敗菌的增長；貯藏后期，處理組冷鮮牛肉的汁液流失率較對照組減少1.73%。復配生物保鮮劑可以將冷鮮牛肉的貨架期有效延長4 d。

關鍵詞：冷鮮牛肉；生物保鮮劑；復配；保鮮；貨架期

Effect of Biological Preservatives in Extending the Shelf-life of Chilled Beef

LI Ruren1， SHEN Rui1， RONG Liangyan1， LIN Shiwen1， ZHANG Peng2， YE Shengde3， LI Jianrong1，*

（1.Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province， National and Local Joint Engineering Research Center of Storage， Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products， College of Food Science and Technology， Bohai University， Jinzhou 121013， China； 2.Tianjin Key Laboratory of Postharvest Physiology and Storage of Agricultural Products，

National Engineering and Technology Research Center for Preservation of Agricultural Products （Tianjin）， Tianjin 300384， China；

3.Zhejiang Silver-Elephant Bioengineering Co. Ltd.， Taizhou 317200， China）

Abstract： Various combinations of three biological preservatives （nisin， natamycin and ε-polylysine） were screened using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods for their efficacy in extending the shelf-life of chilled beef and ensuring its quality and safety during storage. The effect of the selected combination on quality changes of chilled beef was investigated. The results showed that the optimal combination was found to be 2.5 g/L nisin， 1.5 g/L natamycin and 3.0 g/L

ε-polylysine. The total volatile base nitrogen （TVB-N） value of chilled beef treated with this combination after being stored for 8 days at （4 ± 1） ℃ was 19.84 mgN/100 g， reaching the second-grade level of fresh meat. In addition， the total viable count of chilled beef in the treatment group was reduced by 2 orders of magnitude compared with the control group， demonstrating that the combination of preservatives inhibited the growth of spoilage bacteria effectively. At the end of storage life， the drip loss of the treatment group was reduced 1.73% compared with the control group. This treatment extended the shelf-life of chilled beef by 4 days.

Keywords： chilled beef； biological preservative； combination； preservation； shelf-life

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201801005

中圖分類號：TS251.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2018）01-0030-06

引文格式：

李儒仁， 沈瑞， 榮良燕， 等. 生物保鮮劑延長冷鮮牛肉貨架期的效果[J]. 肉類研究， 2018， 32（1）： 30-35. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201801005. http：//www.rlyj.pub

LI Ruren， SHEN Rui， RONG Liangyan， et al. Effect of biological preservatives in extending the shelf-life of chilled beef[J]. Meat Research， 2018， 32（1）： 30-35. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201801005. http：//www.rlyj.pub

牛肉作為一種重要的肉類原料，其市場需求量日益增加。冷鮮肉經歷排酸后熟過程后，蛋白質發(fā)生降解，嫩度明顯提高，有利于人體消化吸收[1]，受到消費者的青睞[2]。然而，冷鮮牛肉貯藏過程中的環(huán)境條件控制不當容易造成致腐微生物的大量增殖，影響產品貨架期，4 ℃冷藏牛肉的貨架期僅為3～5 d[3]，且隨著貯藏時間的延長，牛肉的食用品質及安全性逐漸降低[4]。因此，如何有效提高冷鮮牛肉的貨架期已成為目前亟需解決的問題。

適宜的保鮮方法可以有效延長冷鮮牛肉的貨架期。冷鏈、氣調包裝、超臨界CO2和冷源等離子體等技術可以獲得較好的抑菌效果，但由于成本較高、技術不成熟等問題[5-6]，目前尚未在全國范圍內得到廣泛應用，而化學合成保鮮劑因其便捷性和低成本的優(yōu)勢，被廣泛應用于肉類防腐保鮮。研究表明，乳酸、乙酸、檸檬酸、食鹽等復配處理冷鮮雪花牛肉可使其貨架期延長7 d[7]。然而，消費者對部分化學保鮮劑的安全性存在顧慮[8]，如亞硝酸鹽等在加工過程中容易轉變?yōu)橹掳┪锒谆鶃喯蹁@[8]。

相比于化學合成保鮮劑，植物源防腐劑無毒無害、天然高效，應用前景廣闊[9]。例如，香辛料提取物及精油等通過涂膜保鮮可以有效延長牛肉的貨架期[10]，但受限于成本問題，未被商業(yè)化利用。相比于植物源防腐劑，細菌素等微生物源生物保鮮劑更具優(yōu)勢[11]，其抑菌成分主要來源于生物體本身的分泌或代謝產物，抑菌效果明顯，被廣泛應用于肉類保鮮，通過復配其他保鮮劑或結合物理保鮮方法可以有效提高其保鮮效果[12]。ε-聚賴氨酸與茶多酚、殼聚糖等結合使用可以有效延長冷卻豬肉的貨架期[13]；乳酸鏈球菌素與乳酸聯(lián)合使用，結合氣調包裝對豬肉中的單增李斯特菌屬具有優(yōu)良的抑菌效果[14]；納他霉素與脫氫乙酸、殼聚糖、乳酸鏈球菌素等復配使用可以有效抑制醬鹵肉制品中的致腐微生物[15]。乳酸鏈球菌素、納他霉素和ε-聚賴氨酸單獨使用的效果欠佳，它們分別與其他類型的保鮮劑復配使用時效果相對較好。乳酸鏈球菌素、納他霉素和ε-聚賴氨酸分別與化學保鮮劑及植物源防腐劑復配使用較為常見，但部分化學保鮮劑由于本身不確定的安全隱患逐漸退出歷史舞臺。生物保鮮劑在成本及安全性方面有明顯優(yōu)勢，更容易受到企業(yè)的青睞[16]。上述3 種保鮮劑的抑菌原理類似，均可以通過破壞腐敗菌的細胞膜結構導致其死亡。然而，三者的復配效果如何目前尚不清楚。

本研究通過復配3 種生物保鮮劑（乳酸鏈球菌素、納他霉素和ε-聚賴氨酸），以揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）值、菌落總數(shù)、pH值和汁液流失率等作為評價指標，探究其對冷鮮牛肉貨架期的延長效果，為生物保鮮劑的進一步利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸鏈球菌素、納他霉素、ε-聚賴氨酸（均為食

品級） 浙江新銀象生物工程有限公司；牛肉 錦州大潤發(fā)超市；平板計數(shù)培養(yǎng)基、輕質氧化鎂、氯化鈉。

1.2 儀器與設備

BCD-215KALM冰箱 青島海爾股份有限公司；

LDZX-50FB滅菌鍋 上海申安電器有限公司；JYL-C012絞肉機 九陽股份有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；FJ300-SH數(shù)顯高速分散均質機 上海標本模型廠；LRH-150生化恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒醫(yī)療器械有限公司；Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀 丹麥Foss公司；FE20 pH計 美國Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

牛肉購買后置于冰盒中，立即送往實驗室處理。刀和砧板用75%酒精擦拭消毒后置于超凈工作臺，紫外燈照射20 min；無菌條件下分割牛肉，按實驗所需分為每份40 g、60 g 2 種規(guī)格，無菌水沖淋；將牛肉浸泡于預配保鮮劑中30 min，以無菌水處理作為對照；用無菌濾紙迅速吸干牛肉表面殘留的水分，用滅菌蒸煮袋包裝封口后置于4 ℃冰箱中貯藏，每隔4 d取樣測試。

1.3.2 實驗設計

1.3.2.1 單因素試驗設計

以牛肉貯藏第8天的TVB-N值為評價指標，選取乳酸鏈球菌素、納他霉素和ε-聚賴氨酸的質量濃度3 個因素設計單因素試驗。各因素水平如表1所示。

1.3.2.2 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，以牛肉貯藏第8天的TVB-N值為評價指標，以乳酸鏈球菌素、納他霉素和ε-聚賴氨酸的質量濃度為試驗因子，采用L9（33）正交試驗優(yōu)選出最佳的保鮮劑組合。

1.3.3 菌落總數(shù)測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[17]。

菌落總數(shù)參考標準：一級鮮度為小于4.0 （lg（CFU/g）），二級鮮度為4.0～6.0 （lg（CFU/g）），變質肉大于6.0 （lg（CFU/g））[18]。

1.3.4 TVB-N值測定

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[19]。取10 g絞碎肉樣于蒸餾管，加入1 g氧化鎂粉末，全自動凱氏定氮儀測定。

TVB-N值參考標準：一級鮮度為小于15 mgN/100 g，二級鮮度為15～20 mgN/100 g，變質肉大于20 mgN/100 g[20]。

1.3.5 pH值測定

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》[21]。取5 g絞碎肉樣于燒杯中，加入45 mL蒸餾水，均質，過濾，取濾液用pH計測定。

參考標準：一級鮮度的pH值為5.8～6.2，二級鮮度為6.3～6.6，pH值大于6.7則為變質肉[22]。

1.3.6 汁液流失率測定

參照Davis等[23]的方法，并稍作改進。汁液流失率按照下式計算。

式中：m1為肉樣瀝干水分后的質量/g；m2為用濾紙將肉樣表面水分吸干后的質量/g。

1.4 數(shù)據處理

每個指標均重復測定3 次，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 22.0軟件中的單因素方差分析LSD法與雙變量相關性分析法分析數(shù)據間的相關性與顯著性

（P<0.05）；采用Origin 2017軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 冷鮮牛肉初始TVB-N值

TVB-N是由于致腐微生物以及蛋白酶對肉樣中蛋白質的降解而產生的具有揮發(fā)性的含氮類物質[24]，TVB-N值可用于評價肉品新鮮度[25]。由表2可知，各肉樣初始TVB-N值均在一級鮮度范圍內（<15 mgN/100 g）[20]，符合實驗所需肉樣要求。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乳酸鏈球菌素對冷鮮牛肉的保鮮效果

由表3可知，貯藏8 d后，各處理組冷鮮牛肉的TVB-N值均顯著增加（P<0.05）。貯藏8 d后，對照組冷鮮牛肉的TVB-N值為（23.67±0.98） mgN/100 g，屬于變質肉，顯著高于各處理組（P<0.05）。2.0 g/L乳酸鏈球菌素處理組冷鮮牛肉的保鮮效果最優(yōu)，TVB-N值為（15.45±0.65） mgN/100 g，顯著低于其他處理組

（P<0.05）。因此，正交試驗中選擇乳酸鏈球菌素的添加水平為1.5、2.0、2.5 g/L。

2.2.2 納他霉素對冷鮮牛肉的保鮮效果

由表4可知，貯藏8 d后，各處理組冷鮮牛肉的TVB-N值存在差異。納他霉素質量濃度為1.5 g/L時的保鮮效果較好，冷鮮牛肉的TVB-N值為（9.37±0.34） mgN/100 g，保鮮效果顯著優(yōu)于1.0、2.0 g/L納他霉素處理組（P<0.05）。當納他霉素質量濃度增加至2.0 g/L時，保鮮效果呈下降趨勢，且納他霉素質量濃度為1.0、2.0 g/L時的保鮮效果無顯著差異。因此，正交試驗中選擇納他霉素的添加水平為1.0、1.5、2.0 g/L。

2.2.3 ε-聚賴氨酸對冷鮮牛肉的保鮮效果

由表5可知，貯藏8 d后，不同質量濃度ε-聚賴氨酸處理組冷鮮牛肉的TVB-N值存在差異。ε-聚賴氨酸質量濃度較低時（1.0 g/L），處理組與對照組牛肉的TVB-N值無顯著差異（P>0.05）；隨著ε-聚賴氨酸質量濃度的增加，牛肉的TVB-N值顯著降低（P<0.05）；ε-聚賴氨酸的質量濃度增至5.0 g/L時，其對冷鮮牛肉的保鮮效果已達閾值。其中，2.0 g/L ε-聚賴氨酸處理組牛肉的TVB-N值為（14.58±0.01） mgN/100 g（一級鮮度），顯著低于其他處理組。因此，正交試驗中選擇ε-聚賴氨酸的添加水平為1.0、2.0、3.0 g/L。

2.3 正交試驗結果

由表6～7和圖1可知，貯藏期間各組冷鮮牛肉的TVB-N值均增加。貯藏第4天時，對照組牛肉的TVB-N值為14.08 mgN/100 g，接近一級鮮度的臨界值15 mgN/100 g，而處理組冷鮮牛肉的TVB-N值仍維持在一級鮮度內，且與第0天相比無顯著差異（P>0.05）。貯藏8 d后，對照組牛肉的TVB-N值為21.36 mgN/100 g，大于二級鮮度臨界值20 mgN/100 g，此時，除2號處理組外，各處理組牛肉的TVB-N值均維持在一級鮮度臨界值內，保鮮效果良好。貯藏第12天時，各處理組牛肉的TVB-N值均在二級鮮度范圍內，說明復配生物保鮮劑可以有效抑制冷鮮牛肉貯藏期間TVB-N值的增加，有效延長其貨架期。冷鮮牛肉貯藏期間TVB-N值的影響因素主次關系為乳酸鏈球菌素>ε-聚賴氨酸>納他霉素，說明乳酸鏈球菌素在抑制冷鮮牛肉腐敗變質過程中發(fā)揮關鍵作用。本研究篩選出的最優(yōu)保鮮劑組合為乳酸鏈球菌素2.5 g/L、納他霉素1.5 g/L、ε-聚賴氨酸3.0 g/L。

2.4 驗證實驗結果

對經過正交試驗優(yōu)選出的保鮮劑組合進行驗證實驗，從冷鮮牛肉貯藏期間的菌落總數(shù)、TVB-N值、pH值和汁液流失率4 個方面進行綜合評價，最終確定復合保鮮劑對冷鮮牛肉的保鮮效果。

2.4.1 復配保鮮劑對冷鮮牛肉貯藏期間菌落總數(shù)的影響

致腐微生物的大量繁殖影響冷鮮牛肉貯藏過程中的品質[26]，菌落總數(shù)可以直觀反映肉品新鮮度。由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，冷鮮牛肉的菌落總數(shù)顯著增加，且處理組牛肉的菌落總數(shù)始終低于對照組，表明復配保鮮劑的抑菌效果顯著。貯藏4 d時，對照組牛肉的菌落總數(shù)為6.37 （lg（CFU/g）），屬于變質肉，此時處理組牛肉的菌落總數(shù)為5.35 （lg（CFU/g）），屬于二級鮮肉。貯藏8 d時，與對照組相比，處理組牛肉的菌落總數(shù)下降2 個數(shù)量級，復配保鮮劑對冷鮮牛肉的保鮮效果優(yōu)于茶多酚[27]。

2.4.2 復配保鮮劑對冷鮮牛肉貯藏期間TVB-N值的影響

由圖3可知，由于細菌和酶對蛋白質的分解作用，貯藏期間冷鮮牛肉的TVB-N值呈增加趨勢，且處理組的TVB-N值始終低于對照組，說明復配保鮮劑能有效抑制冷鮮牛肉的TVB-N值增長，這與LI Yingqiu等[28]的研究結果類似。貯藏4 d后，對照組牛肉的TVB-N值達21.44 mgN/100 g，超出二級鮮肉的臨界值20 mgN/100 g，屬于變質肉，此時處理組牛肉的TVB-N值為12.30 mgN/100 g，屬于一級鮮肉。當貯藏時間達到8 d時，處理組牛肉的TVB-N值（19.84 mgN/100 g）仍在二級鮮肉的臨界值（<20 mgN/100 g）內。

2.4.3 復配保鮮劑對冷鮮牛肉貯藏期間pH值的影響

由圖3可知，貯藏期間對照組冷鮮牛肉的pH值呈增加趨勢，這和崔英麗等[29]的研究結果一致。在貯藏過程中，由于蛋白質被分解為胺類及含氮化合物，導致樣品pH值上升[30]。當貯藏時間達到12 d時，對照組牛肉的pH值為6.79，屬于變質肉；處理組牛肉的pH值在貯藏期間增加緩慢且低于對照組，貯藏12 d時的pH值（6.58）仍維持在二級鮮肉pH值范圍（<6.7）內。

2.4.4 復配保鮮劑對冷鮮牛肉貯藏期間汁液流失率的影響

由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，冷鮮牛肉的汁液流失率均呈增加趨勢，貯藏后期，處理組牛肉的汁液流失率低于對照組。當貯藏至12 d時，處理組牛肉的汁液流失率為7.39%，而對照組為9.12%，且差異顯著

（P<0.05）?？梢姡瑥团渖镌幢ｕr劑可以顯著減少冷鮮牛肉貯藏期間的汁液流失。

3 討 論

復配生物保鮮劑可以將冷鮮牛肉的貨架期有效延長4 d，且3 種保鮮劑單一使用均有一定的抑菌效果，提高了冷鮮牛肉的保鮮效果。

乳酸鏈球菌素可以使冷鮮牛肉的TVB-N值顯著降低（P<0.05）。作為多肽抗菌素，乳酸鏈球菌素對單增李斯特菌屬和部分革蘭氏陽性（G+）菌（如沙雷氏菌、金黃色葡萄球菌）等致腐菌具有良好的抑菌作用[31-32]。乳酸鏈球菌素通過降低腐敗菌細胞膜磷脂數(shù)量，抑制細胞膜孔道的形成，阻礙膜內外的信息與能量傳遞，破壞細胞膜結構，進而抑制腐敗菌生長[33]。但由于革蘭氏陰性（G-）菌細胞膜上存在疏水層外膜，通過物理方式阻隔了乳酸鏈球菌素與細胞膜的接觸，從而導致乳酸鏈球菌素對其無抑制作用[31]，因此，單一使用乳酸鏈球菌素的效果有限。

ε-聚賴氨酸對冷鮮牛肉的TVB-N值的增長同樣具有抑制作用。ε-聚賴氨酸具有廣譜抑菌性，對酵母菌、霉菌、G+菌及G-菌具有一定的抑制作用[34]。帶有正電荷的ε-聚賴氨酸能與致腐菌細胞膜表面的負電荷結合，破壞細胞膜的結構，造成細胞質流失，進而導致腐敗菌死亡[35]。

研究表明，ε-聚賴氨酸可能影響微生物的基因表達，導致關鍵蛋白合成受阻，抑制腐敗菌的活性[36]。

納他霉素的抑菌范圍有限，處理組與對照組冷鮮牛肉的TVB-N值差異較小。納他霉素含有的疏水基團與真菌（如霉菌、酵母菌）細胞膜上的甾醇結合，導致細胞膜溶解，從而抑制致腐菌生長，但對于細胞膜上無甾醇結構的腐敗菌無明顯抑制作用[37-38]。

與單一保鮮劑相較而言，復配生物保鮮劑對冷鮮牛肉TVB-N值的抑制作用更加顯著（P<0.05），其原因可能是3 種保鮮劑復配使用擴大了其抑菌范圍，提高了抑菌能力。冷鮮牛肉貯藏初期的優(yōu)勢腐敗菌主要為G-菌（假單胞桿菌、嗜冷桿菌等）；貯藏后期的優(yōu)勢腐敗菌為G+菌（環(huán)絲菌屬等）[39]。貯藏期間的腐敗菌范圍較大，單一保鮮劑的抑菌范圍相對較窄，因此通過復配能夠提高保鮮劑對冷鮮牛肉的保鮮效果。乳酸鏈球菌素、納他霉素和ε-聚賴氨酸作為微生物源防腐劑，其抑菌機理相似，對腐敗菌細胞膜均有一定的破壞作用，3 種保鮮劑復配使用時，其間可能存在協(xié)同作用，對腐敗菌細胞膜的破壞作用增強，從而有效抑制腐敗菌的生長，改善其對冷鮮牛肉的保鮮效果。

冷鮮牛肉貯藏期間的各指標之間存在一定相關性。菌落總數(shù)與TVB-N值呈顯著正相關（r=0.987、

P<0.05），與pH值呈正相關（r=0.923）；pH值與TVB-N值呈正相關（r=0.972）。TVB-N是微生物分解蛋白質產生的揮發(fā)性物質，貯藏過程中致腐菌的增長加速了冷鮮牛肉中蛋白質的分解，導致TVB-N值增加，而這類堿性揮發(fā)性物質的不斷積累導致冷鮮牛肉pH值上升。此外，汁液流失率與菌落總數(shù)之間也存在相關性（r=0.926）。冷藏過程中冷鮮牛肉的汁液流失率較大，不利于冷鮮牛肉的保鮮。研究表明，冷鮮牛肉的水分活度大于0.95時，有利于絕大多數(shù)微生物生長，如梭狀芽孢桿菌、假單胞菌等[40]。并且，流失的汁液中含有大量的水溶性營養(yǎng)物質，這為微生物提供了優(yōu)良的培養(yǎng)基，加速了冷鮮牛肉的腐敗過程。因此，有必要在后續(xù)研究中探索降低汁液流失率的最佳方案。

4 結 論

復配生物保鮮劑可以有效延長冷鮮牛肉保鮮期至8 d，3 種保鮮劑的最佳配比為乳酸鏈球菌素2.5 g/L、納他霉素1.5 g/L、ε-聚賴氨酸3.0 g/L。復配生物保鮮劑有效控制了致腐微生物的生長繁殖，貯藏后期，處理組冷鮮牛肉的菌落總數(shù)較對照組降低2 個數(shù)量級，且貯藏期間處理組冷鮮牛肉的TVB-N值始終顯著低于對照組

（P<0.05）。復配生物保鮮劑維持了肉樣pH值的穩(wěn)定，提高了肉樣的持水力，有效保障了冷鮮牛肉的食用品質和安全性，這對于進一步推廣使用生物保鮮劑具有一定價值。

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