楊志英

(華僑大學體育學院， 福建 泉州 361021)

巨噬細胞廣泛分布于全身各個組織和器官，是機體固有免疫系統(tǒng)的重要成分之一，具有吞噬、抗原提呈和分泌多種細胞因子的功能，在保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、機體防御、炎癥調(diào)控、促進損傷修復等方面起著重要作用[1]。巨噬細胞具有較強的可塑性，靜息巨噬細胞在不同微環(huán)境下可激活分化為表型和功能迥異的兩大類型：炎癥型巨噬細胞和抗炎型巨噬細胞，又稱M1巨噬細胞和M2巨噬細胞，這一過程成為巨噬細胞的極化[2]。

運動的健康促進、疾病防治效應與運動免疫調(diào)節(jié)作用密切相關，有報道表明長期運動能夠通過影響巨噬細胞的極活性從而改善機體免疫力[3]。然而巨噬細胞的極化是一個多因子相互作用的復雜過程，受到細胞內(nèi)多種信號分子及其通路的調(diào)控。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase,JNK)是有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)家族成員之一，已有研究表明，JNK信號通路的激活與體外培養(yǎng)巨噬細胞凋亡有密切關系[4]。本文旨在研究JNK信號通路在長期有氧運動對巨噬細胞極化調(diào)節(jié)機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Hank's液(北京索來寶)；胎牛血清，1640培養(yǎng)液(美國Gibco)；流式周期試劑盒(上海碧云天)；CD206探針(天津三箭)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天)；JNK抗體、β-actin抗體、二抗、ECL發(fā)光液(上海碧云天)；小鼠白介素4(IL-4)ELASA試劑盒(上海滬宇生物)；SP600125(上海碧云天)；Morris水迷宮(北京智鼠多寶DB001型)；高速冷凍離心機(上海盧湘TGL-20M )；超聲破碎器(上海生析FS-250N)；凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂Gel Doc XR+)；流式細胞儀(美國BD FACSCanto II)。

1.2 動物實驗分組級運動方案

選取健康6周齡ICR雄性小鼠48只，隨機分為3組各16只，分別為：正常對照組，低強度游泳訓練組和高強度游泳訓練組。運動方案：游泳訓練組先適應性游泳1周，低強度游泳訓練組：每天20分鐘，連續(xù)45天；高強度游泳訓練組：每天40分鐘，負重3g,連續(xù)45天；正常對照組不做運動訓練；游泳場地：池直徑120cm,高50cm，水溫25℃。

1.3 巨噬細胞的分離及標本收集

運動訓練結束后各組隨機選取10只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.2 ml 2%綿羊血紅細胞以激活小鼠巨噬細胞4天后乙醚麻醉小鼠，腹腔注射加5%胎血清的Hank's液5ml/只，充分洗出腹腔巨噬細胞，吸取腹腔洗液用300目濾網(wǎng)過濾至試管內(nèi)待測。其余每組6只小鼠運動訓練結束后，麻醉，腹主動脈取血。

1.4 巨噬細胞周期檢測

各組分離的細胞標本取106個細胞，離心，1*PBS洗2遍，80%冷甲醇-20℃固定16小時，PBS洗2遍，100ulPBS混勻細胞，各加入500ul/份 PI染液(RNA酶：Tri-X-100:PI:PBS=1:5:5:69)，室溫避光反應30分鐘，流式細胞儀檢測周期。

1.5 巨噬細胞極化分型檢測

根據(jù)文獻確定CD206陽性為M2型巨噬細胞分型標志[5]，各組分離的細胞標本取106個細胞，離心，1*PBS洗2遍，200ul PBS重懸，各組加入CD206探針 5ul/樣,室溫避光反應30分鐘，PBS洗2遍后，上機檢測。

1.6 血清中IL-4檢測

各組小鼠取血后分離血清，按照試劑盒說明書步驟進行操作。

1.7 JNK信號通路抑制體外實驗

細胞系：小鼠巨噬細胞RAW264.7，實驗分組：空白對照組，M2模型組(高強度運動訓練組血清：培養(yǎng)液=1:4)，抑制劑組(SP600125，10uMz終濃度)，聯(lián)合用藥組(血清稀釋液+ SP600125)，培養(yǎng)24小時后，收集標本待測。

1.8 巨噬細胞JNK蛋白免疫印跡檢測

收集各組細胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，定量，上樣，電泳，轉膜，抗原-抗體反應，ECL發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.9 統(tǒng)計方法

統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以百分率表示，計量資料以均數(shù)士標準差表示。組間比較采用單因素方差分析，率比較采用卡方檢驗。P< 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 巨噬細胞周期檢測

與正常對照組相比較，低強度游泳訓練組腹腔提取的巨噬細胞G0/G1期數(shù)量增加、G2M期細胞減少，p<0.05，有統(tǒng)計學差異；高強度游泳訓練組G0/G1期數(shù)量減少、S期和G2M期細胞增加，p<0.05，有統(tǒng)計學差異。

a.正常對照組 b.低強度訓練組 c.高強度訓練組圖1 游泳訓練各組巨噬細胞周期檢測圖

組別G0/G1期S期G2/M期正常對照組73．4%5．3%21．3%低強度訓練組77．3%?5．1%17．6%?高強度訓練組64．8%?7．7%?23．5%?

注：*與正常對照組比較， p<0.05

2.2 血清中IL-4檢測

與正常對照組比較，低強度游泳訓練組血清中IL-4略升高，高強度游泳訓練組血清中IL-4升高，p<0.05，有統(tǒng)計學差異。

表2 游泳訓練各組血清中Il-4含量

注：*與正常對照組比較， p<0.05

2.3 巨噬細胞極化分型檢測

與正常對照組比較，高強度游泳訓練組CD206表達增高，p<0.05，有統(tǒng)計學差異。與空白對照組比較，模型組CD206表達增高，抑制劑組CD206表達降低，p<0.05，有統(tǒng)計學差異。

注：*與對照組比較，p<0.05.圖2 各組巨噬細胞CD206+細胞比例

2.4 巨噬細胞JNK蛋白免疫印跡檢測

與正常對照組比較，高強度游泳訓練JNK蛋白表達含量增高，p<0.05，有統(tǒng)計學差異，見圖3。體外實驗中，與空白對照組比較，模型組JNK蛋白表達增加，抑制劑組JNK表達下降，p<0.05，有統(tǒng)計學差異，見圖4。

2.5 巨噬細胞形態(tài)學觀察

體內(nèi)實驗中，與正常對照組比較，低強度游泳訓練組腹腔巨噬細胞形態(tài)變化不大，高強度游泳訓練組中形態(tài)直徑較大的巨噬細胞數(shù)量增多，見圖5。體外實驗中，空白對照組細胞稱多角形，模型組細胞較圓鈍，抑制劑組出現(xiàn)明顯的偽足，聯(lián)合作用組部分細胞出現(xiàn)較短的偽足，見圖6。

圖3 游泳訓練各組巨噬細胞JNK蛋白表達結果

圖4 體外實驗各組巨噬細胞JNK蛋白表達結果

A：正常對照組 B：低強度訓練組 C：高強度訓練組圖5 游泳訓練各組巨噬細胞1×100倍視野

a：空白對照組 b：模型組 c：抑制劑組 d：聯(lián)合作用組圖6 體外實驗各組RAW246.7細胞1×100倍視野

3 討論

巨噬細胞在體內(nèi)幾乎參與所有的生物學過程，從機體發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和組織修復，到對病原體進行免疫反應等。當機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化時，不同類型的巨噬細胞從血液中的單核細胞存儲池、脾和骨髓中聚集，組織中的巨噬細胞也可以通過自身增殖而增加。在持續(xù)性損傷及微環(huán)境改變的作用下，為了應對組織的生理性變化和環(huán)境對組織的刺激，巨噬細胞不斷地轉換自己的功能表型從而使機體達到一個新的穩(wěn)定狀態(tài)[6]。多年來的研究已經(jīng)表明，長期適度游泳運動可以增強機體免疫力，然而長期高強度的游泳訓練也可以對身體造成多方面的組織損傷和生理變化[7-9]。運動性應激會引發(fā)機體神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)一系列急性反應，對機體的免疫機能會產(chǎn)生不同影響，研究表明，長時間大強度運動后抑制機體免疫機能，主要表現(xiàn)為淋巴細胞數(shù)量減少，增殖活化能力能力降低，延遲性超敏反應降低,Th1向Th2偏離，導致免疫細胞功能降低[10]。也有研究表明長期高強度游泳訓練可引起巨噬細胞M2型極化[11]。本實驗的結果顯示，長期高強度游泳訓練可以導致小鼠巨噬細胞CD206高表達，M2型巨噬細胞數(shù)量增多。M2型巨噬細胞可參與調(diào)節(jié)機體的炎癥反應、適應性免疫反應和碎片清除，并有助于血管發(fā)生、組織重建和組織修復[12]，亦可以分泌多種細胞因子促進Th2型免疫反應。本實驗結果高強度游泳訓練組M2型巨噬細胞數(shù)量的增加也說明長期高強度游泳訓練導致了組織受損，巨噬細胞需通過M2型極化來進行組織修復。

IL-4是具有典型代表意義的Th2細胞因子，是具有多種生物學功能的細胞因子，其經(jīng)典的作用包括刺激細胞和促使B細胞向漿細胞分化以及誘導B細胞分泌IgE，促使Th1型細胞向Th2型細胞分化，同時對多種免疫細胞均有調(diào)節(jié)作用[13]。近年來的研究也發(fā)現(xiàn)，IL-4是誘導巨噬細胞M2型極化的效應物[14]。實驗結果表示，長期高強度游泳訓練可導致實驗動物體內(nèi)IL-4水平上升，而IL-4水平的升高也可能和長期高強度游泳訓練對多系統(tǒng)造成的損傷有關。本次實驗通過檢測運動訓練后動物血清中IL-4水平，并成功采用稀釋性血清誘導巨噬細胞M2型極化，也和其他研究者通過IL-4誘導小鼠巨噬細胞RAW246.7產(chǎn)生M2型極化的結果相一致。

MAPK是哺乳動物細胞內(nèi)廣泛存在的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，目前已鑒定出4種家族成員，分別為細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracelluiar signal regulated kinase 1/2, ERK1/2)、JNK、p83及ERK5。MAPK通路的基本組成是高度保守的三級激酶模式，包括MAPK激酶激酶(MAP kinase kinase kinase，MKKK)、MAPK激酶(MAP kinase kinase，MKK)和MAPK，這三種激酶能依次激活，共同調(diào)節(jié)著細胞的生長、分化、對環(huán)境的應激適應、炎癥反應等多種重要的細胞生理與病理過程，在多種MKKK激酶中，有14種可以激活MKK4/MKK7/JNK信號通路[15]。JNK又被稱為應激活化蛋白激酶(stress-activatedki-nases, SAPK), 是1990年被發(fā)現(xiàn)的促分裂原活化蛋白激酶。JNK信號轉導通路作為MAPK通路的一重要分支，它在細胞周期、生殖、凋亡和細胞應激等多種生理和病理過程中起重要作用，可被應激如電離輻射、滲透壓、熱體克和氧化損傷等多種因素以及多種細胞因子所激活[16]。SP600125也稱Anthrapyrazolone或1,9-Pyrazoloanthrone，是一種常用的泛JNK抑制劑，可顯著抑制JNK介導的c-Jun磷酸化，抑制多個相關基因的表達。有研究表明JNK信號通路與巨噬細胞活化相關[4]，本實驗的結果顯示巨噬細胞通過誘導發(fā)生M2型極化過程中，出現(xiàn)了JNK蛋白的高表達，隨著抑制劑SP600125的干預，巨噬細胞M2極化過程也受到抑制。

細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經(jīng)歷的全過程，包括間期和分裂期。細胞分裂期稱為M期，間期分為三期，即 DNA 合成前期(G1期)、DAN合成期(S 期)與 DNA 合成后期(G2 期)。細胞周期的調(diào)控受多種因素和各種不同的細胞周期蛋白因子的調(diào)節(jié)，研究表明，JNK信號通路受抑制可導致細胞周期阻滯[17]。本實驗的結果顯示，長期高強度游泳訓練可導致巨噬細胞出現(xiàn)周期阻滯，這一過程也可能是和長期高強度游泳訓練所導致機體組織損傷，細胞內(nèi)活性氧水平改變有關[18]，而活性氧的改變又可抑制JNK活性[19]。

4 結論

1)長期高強度游泳訓練可導致小鼠巨噬細胞發(fā)生M2型極化；

2)小鼠巨噬細胞M2型極化與JNK信號通路相關。

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