王志濤，陳源，王鳳霞，陳彥，王先斌,2，吳霜,2

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后肺不張、呼吸衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥是造成SCI患者高死亡率的主要原因[1-2]。除高位脊髓損傷可造成嚴(yán)重的神經(jīng)源性呼吸動力障礙之外，脊髓損傷后繼發(fā)的肺損傷也是導(dǎo)致脊髓損傷患者呼吸功能障礙，甚至致死的重要原因。有研究發(fā)現(xiàn)，在肺損傷大鼠肺組織中檢測到的高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box-1 protein,HMGB1)較正常對照組明顯升高，通過抑制HMGB1的表達(dá)和分泌，可明顯減輕大鼠肺損傷程度，提高大鼠的存活率[3]。而跑臺運(yùn)動訓(xùn)練作為肺康復(fù)的主要康復(fù)訓(xùn)練方法，被廣泛應(yīng)用于SCI、腦卒中等疾病的康復(fù)治療中[4-5]。研究證實(shí)通過跑臺運(yùn)動訓(xùn)練能夠提高全身各肌群包括呼吸肌群的肌力和肌耐力，并改善1秒用力呼氣量(FEV1)等多項(xiàng)肺功能指標(biāo)，改善心肺儲備功能[5-6]。但其對脊髓損傷后繼發(fā)的肺損傷會造成何種影響，目前未見明確報道。本實(shí)驗(yàn)通過對胸段SCI大鼠進(jìn)行跑臺運(yùn)動訓(xùn)練后的帶氧能力、肺組織病理學(xué)改變、HMGB1表達(dá)水平變化等指標(biāo)的檢測以探究跑臺運(yùn)動訓(xùn)練對胸段脊髓損傷后大鼠肺功能，及肺組織內(nèi)HMGB1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 SPF級6周齡SD雌性大鼠，200±20g，實(shí)驗(yàn)動物來源：貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心，質(zhì)量合格證編號SYXK(黔)2018-0001：本動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查通過。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、假手術(shù)組、脊髓損傷非訓(xùn)練組、脊髓損傷訓(xùn)練組，每組各24只。實(shí)驗(yàn)過程中動物處置均符合貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法 ①動物模型制備及術(shù)后護(hù)理：大鼠用10%的水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉。俯臥位四肢外展固定于手術(shù)臺，常規(guī)術(shù)區(qū)備皮、消毒，鋪無菌孔巾。以T10棘突為中心，沿棘突做縱行切口約2 cm，切開皮膚及淺筋膜，并皮下游離。尖刀片緊貼棘突骨面兩側(cè)(以減少因切開肌肉所致肌間出血)做椎旁肌縱行切開，顯微撐開器撐開兩側(cè)椎旁肌，暴露術(shù)野，咬除T10棘突，顯露椎板，蚊式止血鉗橫向輕輕鉗夾摩擦椎板直至顯露硬膜囊外間隙。由尾側(cè)向頭側(cè)咬除椎板直至兩側(cè)椎弓根，完整暴露脊髓。參考趙雪燕等[7]方法，眼科手術(shù)刀于T10節(jié)段處連同硬脊膜和脊髓一同快速切斷，可見大鼠后肢痙攣性抽搐數(shù)次后軟癱，切除2 mm寬脊髓組織，并以彎頭顯微鑷輕抬起脊髓兩斷端，直視下兩人證實(shí)脊髓完全橫斷。創(chuàng)口敷灑慶大霉素。逐層縫合肌肉、筋膜、皮膚，術(shù)畢。假手術(shù)組僅剝離椎板，不傷及脊髓，其他處理均同脊髓橫斷組。大鼠分籠飼養(yǎng)，室溫(23±2)℃，相對濕度(50±10)%，明暗12h交替，飲食水自由攝取。術(shù)后常規(guī)每日慶大霉素(2～4)×104 U/kg 腹腔注射。每天按摩、擠壓膀胱協(xié)助排尿2～3次。為預(yù)防腸梗阻和壓瘡的發(fā)生，每日輕揉大鼠腹部及雙后肢2次并保持皮毛干燥。脊髓損傷非訓(xùn)練組和脊髓損傷訓(xùn)練組在造模過程中各有3只于術(shù)后2～24h死亡，予以及時補(bǔ)充。②干預(yù)方法：脊髓損傷后運(yùn)動組大鼠于術(shù)后第3天開始跑臺運(yùn)動訓(xùn)練，訓(xùn)練過程中根據(jù)大鼠前肢運(yùn)動情況選擇跑臺內(nèi)置的聲音、光照刺激及跑道與大鼠足趾接觸處給與電流刺激，保證大鼠維持在跑道上的持續(xù)運(yùn)動，每日早晚各訓(xùn)練1次，每次訓(xùn)練時間為15min，速度為15m/min[8]。

1.3 評定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 大鼠運(yùn)動功能評價 分別在造模前、造模后即刻、造模后第3天及第14天對所有大鼠采用雙盲法用BBB評分表進(jìn)行運(yùn)動功能評價[9]，該評分表分值為0～21分，0分表示無可見后肢運(yùn)動，21分表示活動正常。

1.3.2 動脈血?dú)夥治?對各組大鼠于術(shù)后第3天、第14天經(jīng)大鼠腹主動脈取動脈血1.5ml做動脈血?dú)夥治?，觀察并記錄動脈氧分壓值(partial pressure of oxygen,PaO2)、動脈二氧化碳分壓值(partial pressure of carbon dioxide,PaCO2)。

1.3.3 肺組織濕/干重比檢測 各組大鼠分別于術(shù)后第3d、14d經(jīng)水合氯醛腹腔注射麻醉，取大鼠整肺，用濾紙吸干表面水分，在電子天平上稱重，得到肺濕重，將肺組織放到65℃烘箱中72h烘干至恒重，在電子天平上稱重，得到肺干重，計(jì)算二者之比。

1.3.4 肺組織HE染色及肺損傷評分 各組大鼠分別于術(shù)后3d、14d經(jīng)水合氯醛腹腔注射麻醉，自左心室插管后剪開右心耳，快速灌注生理鹽水沖洗，待流出的液體清亮后，用4%多聚甲醛經(jīng)心內(nèi)灌注，取出右下葉肺組織，在4%多聚甲醛中固定12 h，入30%蔗糖磷酸鹽緩沖液至組織塊下沉為止。石蠟切片制作15 μm厚切片以備做HE染色及免疫組織化學(xué)染色。取各組大鼠肺組織切片進(jìn)行HE染色，切片在二甲苯(Ⅰ)、(Ⅱ)中各脫蠟10min。順次將切片移入無水乙醇2min、95%、90%、80%乙醇各1min，蒸餾水洗2min。蘇木素染色5min，自來水沖洗。使用0.5%鹽酸乙醇(70%乙醇配制)分化，提插數(shù)下。自來水浸泡15min。使用0.5% 伊紅染液染色2min。依次移入80%、90%、95%及無水乙醇中各1min 進(jìn)行脫水。二甲苯透明2 次，各5min。中性樹脂封片。最后在光鏡下觀察，并用圖像采集系統(tǒng)留取圖片。

1.3.5 肺損傷評分 分別對各組大鼠肺組織進(jìn)行肺損傷評分[10]，取組內(nèi)評分，平均值作為各組大鼠的肺組織損傷程度評分。肺損傷評分標(biāo)準(zhǔn)為：①肺泡充血和間質(zhì)水腫:無異常為0分，輕度異常為1分，中度異常為2分，重度異常為3分;②肺內(nèi)出血：無紅細(xì)胞為0分，極少數(shù)為1分，較多數(shù)為2分，充滿肺泡腔為3分；③肺泡腔或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤或聚集：無白細(xì)胞為0分，極少數(shù)為1分，較多數(shù)為2分，充滿肺泡腔為3分；④肺泡壁增厚和透明膜形成：無透明膜形成為0分，<20%肺泡出現(xiàn)透明膜為1分，20%～50%肺泡出現(xiàn)透明膜為2分，>50%肺泡出現(xiàn)透明膜為3分。

1.3.6 免疫組織化學(xué)染色 取各組大鼠肺組織切片投入PBS緩沖液，經(jīng)抗原修復(fù)液95℃存放20 min，緩沖液清洗2次，再入3%H2O2溶液內(nèi)，室溫20 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶。然后，切片孵育在10%山羊血清溶液中1h，以減少非特異性反應(yīng)。一抗Anti-HMGB1(兔單克隆抗體)經(jīng)1%山羊血清與0.15%Triton X100緩沖液配制。每片滴加100μ一抗Anti-HMGB1(1∶200，貨號：ab79823，Abcam公司)后，在4℃孵育過夜，次日經(jīng)緩沖液洗滌3次后，加相應(yīng)抗兔二抗(1∶400，貨號：ab6721，Abcam公司)溶液，室溫孵育1 h，緩沖液洗滌3次。底物呈色反應(yīng)劑采用DAB(貨號：CDLG-4456，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。呈色反應(yīng)后，切片經(jīng)逐級脫水并中性樹脂封片。每例標(biāo)本測5張切片。HMGB1陽性率的計(jì)算采用陽性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在40倍光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的10個視野，人工計(jì)數(shù)陽性著色細(xì)胞和視野內(nèi)的總細(xì)胞數(shù)，每組5張不同動物組織切片，取被檢各切片之均值。HMGB1陽性率=HMGB1陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分 正常組和假手術(shù)組大鼠BBB評分術(shù)前、術(shù)后第3天、第14天均為21分；SCI非訓(xùn)練組和SCI訓(xùn)練組BBB評分術(shù)前均為21分，術(shù)后第3天評分均為0分，術(shù)后第14天評分均為0～1分。術(shù)后14天 SCI非訓(xùn)練組和SCI訓(xùn)練組BBB評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 動脈血?dú)夥治?術(shù)后第3天，正常組與假手術(shù)組比較，PaO2、PaCO2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與正常組及假手術(shù)組比較，SCI非訓(xùn)練組、SCI訓(xùn)練組PaO2均顯著降低，PaCO2均顯著升高(均P<0.05)；SCI非訓(xùn)練組與SCI訓(xùn)練組比較，PaO2、PaCO2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后第14天，正常組與假手術(shù)組比較，PaO2、PaCO2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與正常組及假手術(shù)組比較，SCI非訓(xùn)練組、SCI訓(xùn)練組PaO2均明顯低于正常組及假手術(shù)組，PaCO2均明顯高于正常組及假手術(shù)組(均P<0.05)。組內(nèi)術(shù)后第14天分別與術(shù)后第3天比較，SCI非訓(xùn)練組和SCI訓(xùn)練組PaO2均明顯升高，PaCO2均明顯降低(均P<0.05)，且SCI訓(xùn)練組較SCI非訓(xùn)練組PaO2升高更顯著，PaCO2下降也更顯著(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠PaO2、PaCO2術(shù)后比較

2.3 肺組織濕/干重比 術(shù)后第3天，正常組與假手術(shù)組肺組織濕/干重比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SCI非訓(xùn)練組、SCI訓(xùn)練組肺組織濕/干重比值均顯著高于假手術(shù)組(均P<0.05)；SCI非訓(xùn)練組與SCI訓(xùn)練組肺組織濕/干重比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后第14d，正常組與假手術(shù)組肺組織濕/干重比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SCI非訓(xùn)練組肺組織濕/干重比值明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；與SCI非訓(xùn)練組比較，SCI訓(xùn)練組肺組織濕/干重比值明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠肺組織在不同時間點(diǎn)濕/干重比值比較

2.4 肺組織HE染色 HE染色結(jié)果顯示，正常組和假手術(shù)組各時間點(diǎn)肺泡結(jié)構(gòu)完整，無紅細(xì)胞滲出及炎性細(xì)胞浸潤，正常組和假手術(shù)組無明顯差別，見圖1；SCI非訓(xùn)練組和SCI訓(xùn)練組大鼠損傷3d后肺組織中毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡壁增厚及肺間質(zhì)可見紅細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤，肺泡破裂，部分肺泡腔融合，見圖2(A、C)；與術(shù)后第3天比較，術(shù)后第14天SCI非訓(xùn)練組、SCI訓(xùn)練組紅細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤、肺泡破裂，部分肺泡腔融合等程度均有所減輕，且SCI訓(xùn)練組較SCI非訓(xùn)練組減輕更加明顯，見圖2(B、D)。肺損傷評分結(jié)果如表3所示。各組大鼠術(shù)后第14天，正常組與假手術(shù)組肺損傷評分，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SCI非訓(xùn)練組、SCI訓(xùn)練組肺損傷評分均顯著高于假手術(shù)組(均P<0.05)，且SCI訓(xùn)練組顯著低于SCI非訓(xùn)練組(P<0.05)。術(shù)后第14天，與假手術(shù)組比較，SCI非訓(xùn)練組、SCI訓(xùn)練組肺損傷評分均顯著增高(均P<0.05)；且SCI訓(xùn)練組顯著低于SCI非訓(xùn)練組(P<0.05)。與術(shù)后第3天比較，術(shù)后第14天SCI非訓(xùn)練組、SCI訓(xùn)練組肺損傷評分均顯著降低(P<0.05)。且SCI訓(xùn)練組肺損傷評分顯著低于SCI非訓(xùn)練組(P<0.05)。

圖1 A～C 肺組織形態(tài)學(xué)；A.正常組14dHE染色結(jié)果；B.假手術(shù)組術(shù)后3d染色結(jié)果C.假手術(shù)組術(shù)后14dHE染色結(jié)果；比例尺=200μm

圖2 A～D 肺組織形態(tài)學(xué)及肺損傷評分結(jié)果；A.非訓(xùn)練組術(shù)后3d HE染色結(jié)果；B.非訓(xùn)練組術(shù)后14d HE染色結(jié)果；C.訓(xùn)練組術(shù)后3d HE染色結(jié)果；D.訓(xùn)練組術(shù)后14d HE染色結(jié)果；比例尺=100μm

表3 4組肺損傷評分結(jié)果比較 分，

2.5 肺組織HMGB1蛋白免疫組化檢測 各組肺組織HMGB1蛋白免疫組化檢測結(jié)果見圖3A～F。術(shù)后第3天，與假手術(shù)組比較，SCI非訓(xùn)練組和SCI訓(xùn)練組肺組織中HMGB1蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(均P<0.05)；SCI非訓(xùn)練組與SCI訓(xùn)練組比較，肺組織中HMGB1蛋白的表達(dá)水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后第14天，與假手術(shù)組比較，SCI非訓(xùn)練組和SCI訓(xùn)練組肺組織中HMGB1蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；但SCI訓(xùn)練組HMGB1表達(dá)量顯著低于SCI非訓(xùn)練組(P<0.05)；且SCI訓(xùn)練組組內(nèi)比較，術(shù)后第14天HMGB1的表達(dá)水平明顯低于術(shù)后第3天時HMGB1的表達(dá)水平(P<0.05)。見表4。

圖3 A～F 各組肺組織HMGB1蛋白免疫組化檢測結(jié)果；HMGB1蛋白陽性如紅色箭頭所示。A.假手術(shù)組，術(shù)后3d；B.假手術(shù)組，術(shù)后14d；C.脊髓損傷非訓(xùn)練組，術(shù)后3d；D.脊髓損傷非訓(xùn)練組，術(shù)后14d；E.脊髓損傷訓(xùn)練組，術(shù)后3d；F.脊髓損傷訓(xùn)練組，術(shù)后14d。比例尺=50μm。

表4 4組HMGB1陽性率結(jié)果比較

3 討論

脊髓損傷不僅導(dǎo)致?lián)p傷平面以下的運(yùn)動、感覺等功能障礙，還將繼發(fā)多種并發(fā)癥，呼吸功能障礙就是其中致死率最高的一種[11]。目前研究認(rèn)為SCI后發(fā)生繼發(fā)性肺損傷的機(jī)制主要包括以下兩方面：①SCI后全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)：SCI后早期不僅會引起損傷脊髓局部的炎癥，還會導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征，造成多器官功能障礙，而肺是SCI后全身炎癥反應(yīng)作用的主要靶器官，SCI后循環(huán)炎癥細(xì)胞激活并向肺、肝、腎等遠(yuǎn)隔器官遷移，在多種細(xì)胞因子的參與下，最終導(dǎo)致繼發(fā)性肺損傷[12]；②神經(jīng)源性肺水腫：神經(jīng)源性肺水腫是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害后肺水腫急性發(fā)作作為主要特征的一種臨床綜合征，可由脊髓損傷引起[13]。有研究已證實(shí)了以上兩種假說，如Bo等[1]用改良Allen法建立大鼠T10水平脊髓挫傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCI后12h，肺組織病理切片可見出血性病變，尤其是雙肺下葉，傷后24h出現(xiàn)肺水腫，傷后3d出血、水腫達(dá)高峰，傷后7d水腫明顯減輕，14d后仍可見明顯出血。Wu等[12]用打擊法建立大鼠T10水平SCI模型，傷后3d肺組織病理切片出現(xiàn)充血、水腫、肺泡結(jié)構(gòu)破壞等肺損傷表現(xiàn)。這些研究表明，大鼠胸段脊髓損傷將會引起肺損傷，其機(jī)制可能即存在遠(yuǎn)隔器官的炎癥反應(yīng)，也存在神經(jīng)源性的肺水腫。本研究結(jié)果顯示，T10水平損傷的大鼠SCI非訓(xùn)練組及SCI訓(xùn)練組，損傷后第3天肺組織病理切片顯示毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡及肺間質(zhì)紅細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤，肺泡破裂，部分肺泡腔融合，肺組織濕/干重比值升高，PaO2下降，PaCO2升高，結(jié)果同以往研究一致。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在第14天時SCI及SCI訓(xùn)練組肺組織病理程度均較前減輕，肺組織濕/干重比值降低，PaO2較前上升，PaCO2較前降低，提示大鼠SCI后的肺損傷可能存在一定的自限性。

大量研究證明，跑臺運(yùn)動訓(xùn)練可保護(hù)脊髓損傷后的骨骼肌質(zhì)量和脊柱四肢的殘余力量，還可能參與調(diào)節(jié)脊髓損傷后抑制性遞質(zhì)的水平，如GABA和甘氨酸[14-15]。而早期跑臺運(yùn)動訓(xùn)練可能通過減輕損傷脊髓水腫、減輕炎癥反應(yīng)、降低細(xì)胞凋亡、減少相關(guān)信號通路對神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的抑制作用，從而改善SCI后大鼠運(yùn)動功能[16]。大鼠脊髓損傷節(jié)段以上的呼吸肌群作為跑臺運(yùn)動中提供有氧代謝的動力，在運(yùn)動功能得到改善的同時也可得以加強(qiáng)。Ching等[17]的研究發(fā)現(xiàn)跑臺運(yùn)動可減輕糖尿病大鼠內(nèi)毒素血癥時肺組織病理損傷，同時使PaO2升高，PaCO2下降，降低內(nèi)毒素血癥大鼠死亡率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)過14d跑臺訓(xùn)練的SCI訓(xùn)練組大鼠各項(xiàng)肺功能指標(biāo)均顯著優(yōu)于SCI非訓(xùn)練組，我們推測跑臺運(yùn)動訓(xùn)練可能有利于大鼠胸段脊髓損傷后肺損傷的恢復(fù)，但其機(jī)制不明。

HMGB1作為一種新的炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，如參與了腦卒中、急性心肌梗死、關(guān)節(jié)炎、哮喘等多種疾病的發(fā)生[18-21]。與CXCL12結(jié)合的完全還原的HGMB1，在組織損傷的初始階段介導(dǎo)炎性細(xì)胞的募集，從而誘導(dǎo)單核細(xì)胞的遷移，并調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的黏附和遷移功能[22]。HMGB1還可介導(dǎo)TNF /IL-1，IL-6，IL-8，CCL2，CCL3，CCL4和CXCL10等細(xì)胞因子/趨化因子的釋放，從而參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[23,25]。目前認(rèn)為在原發(fā)性的肺損傷的發(fā)生發(fā)展中，HMGB1可能發(fā)揮著重要的作用，研究證實(shí)在大鼠肺損傷后，大鼠HMGB-1 mRNA在肺組織中的表達(dá)明顯升高[25]。Liu等[26]的研究指出肺損傷大鼠服用芍藥醇后可通過抑制HMGB1的表達(dá)和分泌，從而使肺損傷大鼠的存活率得到提高。本實(shí)驗(yàn)通過對脊髓損傷后大鼠進(jìn)行跑臺運(yùn)動訓(xùn)練，明顯抑制了大鼠肺組織內(nèi)HMGB1的表達(dá)，大鼠肺功能和肺組織損傷程度均較SCI非訓(xùn)練組獲得明顯改善，提示HMGB1可能參與并介導(dǎo)了SCI后肺損傷的發(fā)生，跑臺運(yùn)動訓(xùn)練可能通過下調(diào)炎癥介質(zhì)HMGB1的表達(dá)，從而減輕了全身炎癥反應(yīng)所致的肺損傷。

通過跑臺運(yùn)動訓(xùn)練可明顯減輕大鼠SCI后肺損傷程度，并下調(diào)HMGB1的表達(dá)，改善SCI后大鼠肺功能。具體機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，有望為臨床指導(dǎo)治療脊髓損傷后肺損傷提供新的理論依據(jù)。