朱毓華，趙允，毛勇，戴絢麗，曾志明，秦丹

（娃哈哈集團(tuán)有限公司質(zhì)量監(jiān)控部，杭州310018）

0　引 言

近年來，芽孢菌已成為乳粉的微生物污染研究中備受關(guān)注的對象[1-2]。乳粉芽孢菌因其優(yōu)良的耐熱性能，往往為乳原料熱殺菌帶來較高風(fēng)險(xiǎn)。而芽孢萌發(fā)后，其抗熱性能會(huì)大大降低，從而大大降低乳粉原料熱殺菌風(fēng)險(xiǎn)。

芽孢萌發(fā)開始吸收水分、鹽類和其他營養(yǎng)物質(zhì)而體積增大、折光率下降、染色性增強(qiáng)，釋放DPA，耐熱性消失，酶活性和呼吸力提高[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)有多重因素可以刺激芽孢萌發(fā)?，F(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)萌發(fā)條件主要有pH值、萌發(fā)劑[4]、高壓[4]、溫度預(yù)處理[6]、化學(xué)物質(zhì)[7]等。芽孢利用一種或幾種小分子物質(zhì)迅速萌發(fā)，如氨基酸、糖類或嘌呤核苷，稱為營養(yǎng)萌發(fā)（nutrient germination），而這些小分子物質(zhì)稱為營養(yǎng)萌發(fā)劑（germinant）[8]。

本研究選擇由乳粉原料中分離的蕈狀芽孢桿菌為代表性的菌株，以芽孢的萌發(fā)率為調(diào)查指標(biāo)，研究了不同條件對蕈狀桿菌芽孢萌發(fā)的影響,為產(chǎn)品生產(chǎn)和原料預(yù)處理提供了方法支持。

1　實(shí) 驗(yàn)

1.1　材料

（1）菌株：實(shí)驗(yàn)用蕈狀芽孢桿菌（Bacillusmycoides）菌株為實(shí)驗(yàn)室自行分離，經(jīng)純培養(yǎng)后API鑒定為蕈狀芽孢桿菌，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室保存命名為NC-1。

（2）產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基。

（3）萌發(fā)緩沖液：pH值為 6.0，濃度為 7.0，8.0 mm o l/L磷酸鹽緩沖液。

（4）萌發(fā)劑：鑒于L-丙氨酸經(jīng)常被選為枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌萌發(fā)劑，故選用L-丙酸作為萌發(fā)劑進(jìn)行條件的摸索。

1.2　儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)，高壓滅菌鍋，生化培養(yǎng)箱，漩渦震蕩儀，顯微鏡，紫外分光光度計(jì)。

1.3　方法

1.3.1芽孢制備

將菌株接種于LB培養(yǎng)基中，溫度30℃，轉(zhuǎn)速200 r/min活化過夜，將活化后的菌液1%接種于CCY培養(yǎng)基，30℃，轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)60 h，鏡檢至體系中孢子率大于99%為止；離心（12 000 r/min，10 min）收集孢子，用滅菌水室溫洗滌和離心10次；最后用萌發(fā)緩沖液懸浮芽孢至OD 600nm≈1.0（近似4.0×108mL-1）。放置于4℃保存，每周用緩沖液洗滌1次[9]。

1.3.2芽孢萌發(fā)的檢測

由于芽孢開始萌發(fā)后，體系在600 nm的光密度隨著萌發(fā)率的增大而降低（芽孢折光性高，而萌發(fā)后吸光性強(qiáng)），并且在此范圍內(nèi)光密度的減小量與芽孢萌發(fā)率成反比。故可通過測量芽孢體系在600 nm的光密度降低率可以計(jì)算芽孢的萌發(fā)率[10]。

1.3.3不同pH值芽孢的生長曲線

在250 mL三角瓶中裝入30 mL LB液體培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)其pH值至6.0、7.0、8.0，滅菌后以10 mL/L接種量接種，溫度36℃（240 r/min）振蕩培養(yǎng)。每小時(shí)測定OD 600 nm光密度值，并涂片觀察萌發(fā)情況。

1.3.4不同濃度L-丙氨酸刺激單因素實(shí)驗(yàn)

制備原濃度為200 mm o l/L和1 000 mm o l/L的

L-丙氨酸溶液，并按照1∶1比例與芽孢萌發(fā)液中進(jìn)行混合，使L-丙氨酸溶液終濃度為100 mm o l/L和500 mm o l/L，每10 min檢測芽孢萌發(fā)率。

1.3.5不同溫度預(yù)處理單因素實(shí)驗(yàn)

用50，60，70℃和80℃四種不同溫度處理芽孢萌發(fā)液，在熱刺激15 min后首次測定萌發(fā)率，熱激完成后轉(zhuǎn)至36℃（240 r/min）振蕩培養(yǎng)30 min，測定最終OD 600 nm值。

1.3.6不同溫度熱刺激及不同濃度L-丙氨酸雙因素實(shí)驗(yàn)

使用pH值7.0磷酸鹽緩沖液，分別配制濃度為0，50，100，200，500 mm o l/L的 L-丙氨酸溶液，過濾除菌，接種一定濃度芽孢孢子記錄初始的OD 600 nm值，每種濃度下L-丙氨酸溶液孢子懸液需經(jīng)不同溫度熱激，分別為50，60，70℃和80℃。熱激15 min后測定OD 600 nm值，熱激完成后轉(zhuǎn)至36℃（240 r/min）振蕩培養(yǎng)30 min，測定最終OD 600 nm值。

2　結(jié) 果

（1）不同pH值條件蕈狀芽孢桿菌萌發(fā)刺激結(jié)果如圖1所示；不同濃度L-丙氨酸中蕈狀芽孢桿菌NC-1萌發(fā)刺激率如圖2所示。

圖1　不同pH值條件蕈狀芽孢桿菌NC-1萌發(fā)刺激

圖2　不同濃度L-丙氨酸條件下蕈狀芽孢桿菌NC-1萌發(fā)率

在萌發(fā)溫度37℃，使用pH值為6.0，7.0，8.0的緩沖液，萌發(fā)劑為L-丙氨酸（濃度50 mm o l/L）混合物的固定條件下，蕈狀芽孢桿菌NC-1芽孢在pH值7.0的緩沖液中萌發(fā)速度最快（圖1）；芽孢在pH值為6.0和pH值為8.0開始萌發(fā)的時(shí)間至少推遲近兩小時(shí)（圖2）?？梢?，蕈狀芽孢桿菌芽孢在中性環(huán)境中可以迅速萌發(fā)。

由圖2可以看出，以L-丙氨酸作為萌發(fā)劑條件下，濃度500 mm o l/L的L-丙氨酸可使芽孢在60 min內(nèi)達(dá)到80.20%，而濃度為100 mm ol/L的L-丙氨酸僅在60 min內(nèi)達(dá)到41.40%，較高濃度處理得到較大萌發(fā)率。（2）熱激對蕈狀芽孢桿菌NC-1的萌發(fā)刺激

單純熱刺激的萌發(fā)情況如表1所示。由表1可以看出，熱刺激可以促使芽孢萌發(fā)，在熱刺激單因素作用下，50～80℃范圍內(nèi)，溫度越高所得萌發(fā)率越高。

表1　單純熱刺激下蕈狀芽孢桿菌萌發(fā)率 %

熱刺激+L-丙氨酸雙因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，50～80℃熱刺激15 min為最優(yōu)溫度條件；50～500 mm o l/L L-丙氨酸濃度范圍內(nèi)，L-丙氨酸濃度的越高，萌發(fā)率越高。能夠達(dá)到＞90%萌發(fā)率的處理需至少添加100 mm o l/L L-丙氨酸，并接受80℃熱刺激15 min后，保溫30min。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)最優(yōu)萌發(fā)條件應(yīng)為80℃熱刺激15 min且500 mm o l/L L-丙氨酸，其僅在熱激15 min后，即可達(dá)到萌發(fā)率94.41%，36℃搖床30 min后更可達(dá)到接近100%的萌發(fā)率。

表2　50 mmol/L L-丙氨酸和100 mmol/L L-丙氨酸的萌發(fā)率 %

表3　200 mmol/L L-丙氨酸和500mmol/L L-丙氨酸的萌發(fā)率 %

3　結(jié) 論

乳飲料或乳制品產(chǎn)品的乳粉原料中普遍存在芽孢桿菌，其難以被殺滅，而其萌發(fā)后抗性大大降低，給食品滅菌、食品風(fēng)味的保持、延長食品保藏期等帶來好處。研究在乳飲料或生產(chǎn)配制過程中更高效使芽孢萌發(fā)從而被輕易地殺滅的條件，以及運(yùn)用多種誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)因素的組合是一個(gè)重要的思路。蘇云金芽孢桿菌可單獨(dú)利用L-丙氨酸或肌苷萌發(fā)[11]，而炭疽芽孢桿菌不能單獨(dú)利用肌苷萌發(fā)[12]，蠟樣芽孢甚至于在37℃100 mmol/L L-丙氨酸條件下，15 min即可使95%以上的的芽孢萌發(fā)為繁殖體[13]。對于蕈狀芽孢桿菌，目前國內(nèi)外報(bào)道主要集中于分類研究，對于其萌發(fā)營養(yǎng)途徑的研究比較空白。本文以乳粉中分離的蕈狀芽孢桿菌為代表，研究了蕈狀芽孢桿菌的萌發(fā)最優(yōu)萌發(fā)條件應(yīng)為80℃熱刺激15 min且500 mm o l/L L-丙氨酸，36℃搖床30 min后更可達(dá)到接近100%的萌發(fā)率。這些數(shù)據(jù)的積累為生產(chǎn)實(shí)踐中的工藝方法調(diào)整做好基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]SCOTT SA，BROOKS J D，KAKONJAC J.The Formaiton of Thermophilic Spores during the Manufacture of Whole Milk Powder[J]International Journal of Dairy Technology，2007，60（2）：109-117．

[2]ILUCKEKT A，RONIMUSR S，MOR.GAN H W.A R.APD-Based Survey of The rmophilic Bacilli in Milk Powders from Different Countries[J].International Journal of Food Microbiology，2004，96（3）：263-272．

[3]何國慶，賈英民.食品微生物學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002：31-33.

[4]PAIDHUNGAT M，SETLOW P.Spore Germination and Outgrow th[M].Hoch JA，Losick R，Sonenshein AL.Bacillus subtilis and its relatives：fromgenes to cells.Washington，DC：American Society for Microbiology，2002：537-48.

[5]高媛，周先漢，曾慶梅，等.高壓CO 2處理對枯草芽孢桿菌芽孢殺滅及協(xié)同作用的影響[J].食品科學(xué)，2011，32（11）：64～68.

[6]陳國華，馮書亮，曹偉平，等.溫度預(yù)處理對蘇云金桿菌芽孢萌發(fā)的影響[J].中國生物防治，2004，20（5）：127～130.

[7]王一曉，張海紅，章中.理化因素誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)研究2016，37（3）：58～64.

[8]沈萍.微生物學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2000：51-57.

[9]HORNSTRA LM，VR IESY P，VOSW M，et al.Ger R，a novel geroperon involved in L-alanine-and inosine initiated germination of Bacillus cereus ATCC 14579[J].Applied and Environmental Microbiology，2005，71：774-781.

[10]CLEMENTSM O，MOIR A.Role of the gerIoperon of Bacilluscereus 569 in the response of spores to germinants[J].The Journal of Bacteriology，1998，180：6729-6735.

[11]吳艷艷，孫長坡，高繼國，等.蘇云金芽孢桿菌HD-73菌株芽孢萌發(fā)條件的優(yōu)化及質(zhì)粒pHT73對芽孢萌發(fā)的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2007，9（3）：98～103.

[12]高志奇、劉先凱、王恒樑.炭疽芽孢桿菌萌發(fā)進(jìn)展[J].軍事醫(yī)學(xué)，2014,10（38）：833～836.

[13]李曼，侯利華，曹曉梅，等.乳酸鏈球菌素對蠟樣桿菌芽孢作用的初步研究[J].中國消毒學(xué)雜志，2009；26（2）：126～128.