畢瑞鋒

（諾安實力可商品檢驗（青島）有限公司，山東青島266002）

0　引 言

近年來，乳及乳制品中高氯酸鹽和氯酸鹽污染引起消費者和生產(chǎn)者的普遍關(guān)注。高氯酸鹽是一種持久性污染物[1]，苜蓿、麥芽等飼料對高氯酸離子具有很強(qiáng)的生物富集能力[2]，且牛奶中高氯酸鹽含量和動物高氯酸鹽的攝入量呈明顯的正相關(guān)[3-4]；氯酸鹽是二氧化氯消毒產(chǎn)生的副產(chǎn)物。高氯酸鹽和氯酸鹽長期暴露對人體的影響主要表現(xiàn)為對甲狀腺吸收碘離子的抑止，歐盟食品安全局（EFSA）設(shè)定高氯酸鹽和氯酸鹽的每日耐受攝入量（TD I）分別為0.3μg/kg b.w.和3 μg/kg b.w.。

目前高氯酸鹽和氯酸鹽的檢測方法主要有離子色譜法[5-7]、離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8-10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-15]等。本文基于非修飾多孔石墨化碳柱分離的HPLC-MS/MS，建立了牛奶中高氯酸鹽和氯酸鹽的檢測方法。

1　實 驗

1.1　儀器和試劑

AB Sciex 5500 Q TRAP液相色譜—三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；15 mL聚苯乙烯離心管；聚四氟乙烯針頭過濾器。

高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液（質(zhì)量濃度1 000 mg/L）；氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液（質(zhì)量濃度100 mg/L）；乙腈、甲醇、正己烷（HPLC級）；乙酸（分析純）；C 18粉；實驗用水為超純水（18.0 MΩ·cm）。

1.2　標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

移取100μL質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品至10 mL的容量瓶中，用超純水定容至刻度，此為高氯酸鹽高標(biāo)儲備液（質(zhì)量濃度10 mg/L）；中間混標(biāo)的配制：分別移取80μL高氯酸鹽高標(biāo)儲備液和30μL質(zhì)量濃度為100 mg/L的氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液至10 mL的容量瓶中，用超純水定容至刻度；工作標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：移取1 mL中間混標(biāo)至10 mL的容量瓶中，用超純水定容至刻度。

1.3　色譜條件

Thermo Hypercarb色譜柱（100 mm×2.1 mm，5 μL）。流動相：A為1%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸水溶液；B為甲醇；梯度洗脫程序：0～5.0 min，95%A；5.0～6.0 min，95%A～5%A；6.0～9.5 min，5%A；9.5～10.0 min，5%A～95%A；10.0～15.0 min，95%A。流速為 0.4 mL/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為2μL。

1.4　質(zhì)譜條件

電離方式為電噴霧負(fù)離子源（ESI-）；檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測模式（M RM）；電噴霧電壓為-4 500 V；離子源溫度450℃；其他質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1　高氯酸鹽和氯酸鹽的質(zhì)譜參數(shù)

1.5　樣品前處理

準(zhǔn)確移取2.00 g牛奶樣品至15 mL離心管。加入6 mL乙酸+甲醇+乙腈（1+10+90，體積比）溶液，渦旋1 min，轉(zhuǎn)速為3 500 r/min下離心10 min。移取2 mL上清液至15mL離心管，添加1 mL正己烷，渦旋，轉(zhuǎn)速為3 500 r/min下離心5 min，取下層溶液過0.45μm針頭過濾器至進(jìn)樣小瓶中。

2　結(jié)果與討論

2.1　質(zhì)譜條件的建立

分別配制濃度為100μg/L的高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，在負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子掃描，得到高氯酸根離子的母離子m/z 98.9（35C lO4-）和m/z 101.9（37C lO4-）。打開子離子模式，氯氧鍵斷裂，分別失去一個氧原子和兩個氧原子得到子離子，質(zhì)荷比按照響應(yīng)大小分別為m/z 82.9（35C lO3-）；m/z 84.9（37C lO3-）；m/z 66.9（35C lO2-）和m/z 68.9（37C lO2-），選擇z/m 82.9作為定量離子，其他離子作為定性離子。

按照相同的方法得到氯酸鹽的母離子為m/z 82.9（35C lO3-）和m/z 84.9（37C lO3-），m/z 66.9（35C lO2-）為定量離子，m/z 68.9（37C lO2-）、m/z 50.9（35C lO-）和m/z 52.9（37C lO-）為定性離子。同時對去簇電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2　色譜條件的優(yōu)化

多孔石墨化碳（porous graphitic carbon，PGC）是一種特殊的固定性，其對在反相鍵合相色譜柱（C 18）上難保留的極性化合物具有很好的吸附能力，這種現(xiàn)象被稱為“石墨的極性保留效應(yīng)”（polar retention effect on graphite，PREG）[16]。以水為流動相、羧酸為電子改性劑可以實現(xiàn)無機(jī)陰離子在PGC柱上的保留和分離[17]，實驗選擇與質(zhì)譜電噴霧離子源兼容的乙酸（體積比為1%）作為電子改性劑。通過調(diào)整流動相中甲醇的比例，考察了甲醇比例對兩種無機(jī)陰離子保留值的影響，結(jié)果表明，兩種無機(jī)陰離子保留因子的自然對數(shù)lnk與甲醇均呈較好的線性關(guān)系，流動相中甲醇比例增加，保留值增大。但甲醇比例大于10%之后，高氯酸鹽逐漸出現(xiàn)峰形變寬，靈敏度降低。將流動相中甲醇比例設(shè)定為5%，可有效分離兩種無機(jī)陰離子，同時保證分析物的峰寬和高靈敏度（圖1）。

然而，按照上述流動相比例運行一段時間后，會出現(xiàn)柱壓上升、保留時間漂移等現(xiàn)象，影響實驗的重現(xiàn)性。其原因可能是PGC柱保留極性無機(jī)陰離子的同時吸附了其他非極性的基體雜質(zhì)，在高氯酸鹽和氯酸鹽的分離條件下，固定相上的雜質(zhì)不能洗脫下來，越積越多，導(dǎo)致柱壓升高；由于雜質(zhì)占據(jù)了目標(biāo)物的活性位點，致使色譜峰保留時間發(fā)生改變。由于PGC柱傳統(tǒng)的再生方式耗時且復(fù)雜，Bapiro等[18]建議用甲醇/水（95∶5，體積比）的流動相沖洗PGC柱，因此在目標(biāo)物出峰后，流動相逐漸過渡到體積分?jǐn)?shù)為95%甲醇并維持5 min（圖2）。

圖2中，cps全稱為count per second，其物理意義為每秒檢測到的離子個數(shù)。

2.3　樣品前處理方法的優(yōu)化

牛奶中主要有蛋白質(zhì)和脂肪，樣品前處理的目的是提取目標(biāo)物同時去除蛋白質(zhì)和脂肪等樣品基體雜質(zhì)。高氯酸鹽和氯酸鹽的提取溶劑主要有水、甲醇和乙腈。由于甲醇對牛奶中蛋白的沉淀效果較差，乙腈對蛋白的沉淀效果雖然好，但直接用乙腈提取牛奶時，容易出現(xiàn)乙腈相和水相的分層現(xiàn)象，以乙腈為主要提取溶劑，加入10%甲醇有效改善沉淀蛋白時乙腈相和水相之間的互溶性。由于酸性條件有利于蛋白質(zhì)的沉淀，實驗選用乙腈-甲醇-乙酸溶液（90∶10∶1，體積比）作為提取溶液。

實驗考察了使用正己烷去除脂肪的效果，移取2 mL樣品提取溶液至15 mL離心管中，分別加入1 mL正己烷，充分混合1 min后離心，過0.45μm濾膜后測定。凈化效果可通過基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價，基質(zhì)效應(yīng)=S2/S1（其中S1為標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值，S2為基質(zhì)提取溶液添加標(biāo)準(zhǔn)品后的響應(yīng)值扣除未添加時的響應(yīng)值）。未凈化的基質(zhì)提取溶液表現(xiàn)為明顯基質(zhì)抑制效應(yīng)，用正己烷凈化后高氯酸鹽和氯酸鹽的基質(zhì)效應(yīng)分別為90.9%和94.6%，基質(zhì)效應(yīng)可以忽略，因此實驗采用正己烷進(jìn)行凈化。

圖1　甲醇比例對兩種無機(jī)陰離子保留值k的影響

圖2　高氯酸鹽和氯酸鹽的色譜圖

2.4　線性范圍與定量限

由于牛奶中普遍存在高氯酸鹽的污染，較難得到用于配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品的空白基質(zhì)樣品，并且按照1.5節(jié)方法處理樣品，可以忽略基質(zhì)效應(yīng)，因此實驗采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)品校正法。稀釋1.2節(jié)制備的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液至1/40，1/20，1/10，1/5，1/2和1倍，得到一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定。以峰面積對質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果（表2）表明，高氯酸鹽和氯酸鹽在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.999。綜合考慮樣品量和提取溶劑體積，按照S/N≥10確定高氯酸鹽的定量限（LOQ）為0.8μg/kg；氯酸鹽的LOQ為3μg/kg。

表2　高氯酸鹽和氯酸鹽的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（r2）和定量限

2.5　回收率和精密度

通過基質(zhì)篩選，在一個污染水平較低的牛奶樣品上進(jìn)行5倍和10倍定量限兩個濃度水平的添加回收試驗，每個水平做6個平行，結(jié)果如表3所示，高氯酸鹽的平均回收率分別為85.0%和83.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.0%和2.2%；氯酸鹽的平均回收率分別為97.3%和86.0%之間，RSD為3.9%和8.8%。

表3　高氯酸鹽和氯酸鹽的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.6　實際樣品測定

采用該方法對大型超市售賣的7個牛奶樣品（配料只含生牛乳）進(jìn)行了檢測，每份樣品重復(fù)檢測3次，結(jié)果如表4所示，高氯酸鹽檢出率為100%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（7.6±0.3）～（33.9±0.4）μg/kg；4個樣品檢出氯酸鹽，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（4.8±0.1）～（30.5±0.9）μg/kg，剩下3個樣品的氯酸鹽結(jié)果為陰性。

表4　實際牛奶樣品中2種無機(jī)陰離子的分析結(jié)果（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差） μg/kg

3　結(jié) 論

本文基于非修飾多孔石墨化碳柱的HPLC-MS/MS技術(shù)建立了牛奶中的高氯酸鹽和氯酸鹽的檢測方法。該法充分考慮了前處理方法和儀器方法、色譜系統(tǒng)和質(zhì)譜系統(tǒng)之間的匹配性與兼容性，檢測過程簡單快速，提高了樣品檢測的通量，適合批量牛奶樣品中高氯酸鹽和氯酸鹽的日常監(jiān)測和質(zhì)量控制。

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