佳木泰，林曉龍，吳敬，郭海燕，芒來(lái),道楞

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)a.動(dòng)物科學(xué)學(xué)院；b.食品科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018）

0　引言

通過(guò)近些年研究，干酪乳桿菌劃分出新種，即副干酪乳桿菌（L.paracasei）。L.paracasei耐酸、N aC l及膽汁鹽，并具抗過(guò)敏作用[1]。其被劃分為干酪乳桿菌菌群[2]。

乳酸菌產(chǎn)的乳酸、乙酸、CO2、H2O2、細(xì)菌素等具有抑菌活性[3-4]。J Lozo報(bào)道L.paracasei BGBUK 2-16能產(chǎn)生具有抑菌作用的細(xì)菌素[5]。M.Atanassova也提出L.paracasei subsp M 3可產(chǎn)抑制細(xì)菌、真菌的物質(zhì)，鑒定為類細(xì)菌素[6]。高瑩等得出L.paracasei HD 1.7對(duì)B.subtilis的作用方式為抑菌[7]。滕志利提出L.plantarumA8對(duì)Escherichia coli的作用方式為殺菌[8]。Caridi A等人發(fā)現(xiàn)Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei BGBUK 2-16所產(chǎn)抑菌物質(zhì)可低溫儲(chǔ)存[9]。因此L.paracasei所產(chǎn)細(xì)菌素有望成為食品防腐劑。

本研究篩選分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品中的乳酸桿菌，得到副干酪乳桿菌Q-1-4，并對(duì)其進(jìn)行生理生化和分子生物學(xué)鑒定，確定所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的性質(zhì)，為開發(fā)具有新型生物防腐劑功能的細(xì)菌，細(xì)菌素奠定了基礎(chǔ)。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1　菌株

由內(nèi)蒙古牧區(qū)家庭以傳統(tǒng)發(fā)酵法制作的酸馬奶樣品中分離了本實(shí)驗(yàn)所需的8株乳酸菌。不同類型的指示菌—革蘭氏陰性菌4株、革蘭氏陽(yáng)性菌7株。以上菌株均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品生物技術(shù)團(tuán)隊(duì)提供。

1.2　培養(yǎng)基

以參考文獻(xiàn)[10-11]備注的培養(yǎng)基配制方法為參考。

1.3　試劑

過(guò)氧化氫酶(2 000～5 000 U/mg)購(gòu)于美國(guó)Sigm a公司；胃蛋白酶（3 000 U/mg）、胰蛋白酶(250 U/mg)購(gòu)于北京Amersco公司；木瓜蛋白酶（6 000 U/mg）、蛋白酶K(40 m Ansom U/mg)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒；其他化學(xué)試劑：甲醇、乙醇、丙酮、丁醇、氯仿；吐溫 20、吐溫 80、Tx-100、SDS、EDTA、尿素；硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸鎂、氯化鋇、氯化鈣均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4　儀器

HPS-250生化培養(yǎng)箱；PB-10 pH計(jì)；BCN-1360型生物超凈工作臺(tái)；CP1502C電子天平；PCR儀；RE-52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；KDC-140HR高速冷凍離心機(jī)。

1.5　方法

1.5.1乳酸菌的活化以及無(wú)細(xì)胞上清液的制備

將半固體穿刺保藏好的試驗(yàn)菌株接種于5 mL的M RS液體培養(yǎng)基中，放置培養(yǎng)箱里37℃培養(yǎng)24 h，按2%的接種量活菌傳3代，將最后一代液體培養(yǎng)物在離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速為6 000 r／min的速率離心15 min（4℃）后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清液濃縮10倍，0.45μm孔徑的濾菌器過(guò)濾除菌，得到CFS，置于4℃保存?zhèn)溆肹13]。

1.5.2指示菌菌懸液的制備

將保存的指示菌挑單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后，以2%的接種量再活化2代，第3代培養(yǎng)24 h后。用0.85%無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋至菌懸液濃度為106mL-1，4℃保存待用。

1.5.3抑菌活性的測(cè)定

采用雙層瓊脂平板擴(kuò)散法檢測(cè)待檢菌中是否具有抑菌活性[14]，采用雙層瓊脂平板擴(kuò)散法，以枯草芽孢桿菌（B.subtilis CGMCC 1（B）63501）為指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.5.4產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的乳酸菌篩選

1.5.5產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌的鑒定

采用常規(guī)的形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定及16S rRNA序列分析進(jìn)行種屬的鑒定。

（1）菌體形態(tài)和生理生化鑒定。將半固體保存的試驗(yàn)菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，傳兩代。在固體培養(yǎng)基上劃線37℃培養(yǎng)48 h后，觀察菌落形態(tài)及菌體形態(tài)。

通過(guò)形態(tài)觀察，對(duì)篩選出的乳酸菌菌株做常規(guī)的生理生化試驗(yàn)：過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、發(fā)育溫度試驗(yàn)（15℃、45℃生長(zhǎng)）和糖發(fā)酵試驗(yàn)等。根據(jù)《乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》[15]和《常見細(xì)菌系作用的乳酸菌基因組總DNA，并以此DNA為模板，利用細(xì)菌rDNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17]，用于擴(kuò)增的引物為一對(duì)通用引物，正向引物為27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′，反向引物為1495r：5′，-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，58℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，30次循環(huán)，最后72℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行測(cè)序。將獲取的序列結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)種屬的序列進(jìn)行比對(duì)，利用DNAStar軟件構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

1.5.6L.paracasei Q-1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的確定

（1）酸及酸性末端產(chǎn)物作用的排除。為排除酸性末端產(chǎn)物的干擾，將濃縮10倍的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液pH調(diào)至5.0和5.5，采用調(diào)配成相同pH值的乳酸和乙酸為對(duì)照，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

（2）過(guò)氧化氫的檢測(cè)與排除。由濃度為50 mm o l/L的磷酸緩沖液（pH=7.0）溶解過(guò)氧化氫酶配成母液，按終質(zhì)量濃度為1 mg/mL加入到排酸后的CFS中，37℃溫浴2 h取出后在水浴箱100℃煮沸5 min使酶滅活，再調(diào)至排酸pH后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

（3）蛋白酶對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響。將各酶溶解在pH=7.0的磷酸緩沖液中配成母液(胃蛋白酶溶解在pH 2.0的磷酸緩沖液中)，將5份等量的CFS的pH調(diào)至胰蛋白酶、蛋白酶K、溶菌酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的最適pH(依次為7.6，7.0，6.5，2.0，6.2)，按終質(zhì)量濃度1.0 mg/mL加入各酶液，37℃溫浴2 h后100℃水浴5 min使酶滅活[18]。將pH值調(diào)至排酸pH值，以未經(jīng)酶處理CFS為對(duì)照，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.6　L.paracasei Q-1-4的抑菌動(dòng)力學(xué)曲線

將待測(cè)菌株接種于裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管中37℃恒溫培養(yǎng)，每間隔2 h在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)光密度值，共測(cè)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，得到乳酸菌的生長(zhǎng)曲線[19]，同時(shí)以B.subtilis CGM CC 1（B）63501做指示菌，采用雙層瓊脂平板擴(kuò)散法，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間菌株無(wú)細(xì)胞上清液的抑菌活性。

1.7　L.paracasei Q-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的特性

1.7.1抑菌物質(zhì)的pH穩(wěn)定性

分別用濃度為1 m o l/L的HC l和1 m o l/L的NaOH將該菌的CFS pH值調(diào)為2.0，3.0，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0；以調(diào)配成相同pH值的MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.7.2抑菌物質(zhì)在不同pH值下的熱穩(wěn)定性

將調(diào)至不同pH值的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液分別于60，80，105，121℃下處理30min，冰浴急冷后，將未經(jīng)溫度處理的CFS為對(duì)照，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.7.3抑菌物質(zhì)的紫外線敏感性

取等量的CFS，并將其平鋪于滅菌平皿中，輸出調(diào)至40 W的紫外燈下距離40 cm分別輻照10，30，統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[16]中描述的特征進(jìn)行分析，確定其菌株歸屬。

（2）分子生物學(xué)鑒定。提取所純化的具有抑菌120 min，將未經(jīng)紫外處理的CFS為對(duì)照[13]，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.7.4有機(jī)溶劑對(duì)抑菌物質(zhì)的影響

將甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、丁醇加入到CFS中，使終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%。將未經(jīng)有機(jī)溶劑處理的CFS與加入相同有機(jī)溶劑濃度處理的M RS液體培養(yǎng)基為對(duì)照[20]，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.7.5表面活性劑對(duì)抑菌物質(zhì)的影響

將Tw een 20、Tw een 80、Tx-100、乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、尿素(U rea)加入到CFS中，使終濃度為1.0%。將未經(jīng)表面活性劑處理的CFS和加入相同表面活性劑濃度處理的M RS液體培養(yǎng)基為對(duì)照[21]，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.7.6金屬離子對(duì)抑菌物質(zhì)的影響

將溶解在濃度為50 mm o l/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）中的不同金屬離子（包括FeSO4，ZnSO4，Cu-SO4，BaC l2，CaC l2，mgSO4）溶液分別按 1:1的體積與CFS混合。將未經(jīng)金屬離子處理但加入相同體積超純水的CFS和加入相同金屬離子濃度處理的M RS液體培養(yǎng)基為對(duì)照[22]，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.7.7抑菌物質(zhì)保藏的穩(wěn)定性

將代謝產(chǎn)物分別在常溫，4℃和-20℃下儲(chǔ)藏0，20，40，60 d；檢測(cè)不同溫度及不同時(shí)間的儲(chǔ)藏對(duì)指示菌抑菌活性的變化[23]。

1.7.8L.paracaseiQ-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌譜

將各類革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌活化傳3代，第3代的培養(yǎng)菌數(shù)進(jìn)行梯度稀釋調(diào)至106mL-1，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.8　數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)三個(gè)平行，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示，用軟件SPASS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與討論

2.1　產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)乳酸菌的篩選

將使用雙層瓊脂平板擴(kuò)散法，以革蘭氏陽(yáng)性菌B.subtilisCGMCC 1（B）63501為指示菌，對(duì)內(nèi)蒙古牧區(qū)家庭傳統(tǒng)手工工藝制作的酸馬奶中的8株乳酸桿菌進(jìn)行抑菌活性菌株篩選，結(jié)果見表1。

表1　乳酸菌的抑菌活性

由表1可以看出，8株乳酸桿菌均對(duì)指示菌有抑制作用。從中選取抑菌效果較好的Q-1-4進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2　產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌的鑒定

2.2.1菌體形態(tài)和生理生化鑒定

將菌株分離純化后，在MRS固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24 h之后的菌落特征見圖1。光學(xué)顯微鏡下菌體形態(tài)由圖2所示。菌株Q-1-4生理生化鑒定結(jié)果如表2所示，呈短桿狀，成對(duì)或成鏈狀排列，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，無(wú)芽孢。表中這些生理生化特征與文獻(xiàn)[24]中描述得L.paracasei的特征相同，初步鑒定歸入副干酪乳桿菌。在公布的乳桿菌屬和種的分類中，德國(guó)微生物與細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心將副干酪乳桿菌直接劃分為干酪乳桿菌菌群[2]。由于副干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌以及干酪乳桿菌中的其它亞種具有很高的相似性，需要結(jié)合分子生物學(xué)試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行鑒定。

菌落特征如圖1所示；光學(xué)顯微鏡下菌體形態(tài)如圖2所示；生理生化鑒定結(jié)果如表2所示。

表2　菌株Q-1-4的生理生化特征

圖1　乳酸菌Q-1-4的菌落形態(tài)特征

圖2　乳酸菌Q-1-4的菌體形態(tài)（10×100）

2.2.2分子生物學(xué)學(xué)鑒定

以菌株Q-1-4的DNA為模板，采用16S rDNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度為1500 bp的16SrDNA堿基序列。將其與GenBank中已知菌株的基因序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果見表3，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

表3　菌株Q-1-4的同源性分析

圖3　菌株Q-1-4的系統(tǒng)發(fā)育樹

由表2和圖3可以看出，實(shí)驗(yàn)菌株和已知菌的親緣關(guān)系，菌株Q-1-4與L.paracasei同源性高達(dá)99.2%，在進(jìn)化樹中處于同一分支，故判定Q-1-4為L(zhǎng).paracasei。將生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)試驗(yàn)相結(jié)合，認(rèn)定菌株Q-1-4為L(zhǎng).paracasei。

2.3　 L.paracasei Q-1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的確定

2.3.1酸與過(guò)氧化氫作用的排除

由于乳酸菌在代謝中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫和酸性末端產(chǎn)物也可抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，故應(yīng)排除過(guò)氧化氫和酸的干擾，結(jié)果如表4所示。

表4　酸與過(guò)氧化氫作用的排除

由表4可以看出，pH 5.0的乳酸、乙酸對(duì)B.subtilisCGMCC1（B）63501沒有抑制作用，而 pH 5.0的L.paracaseiQ-1-4產(chǎn)生的CFS對(duì)其有明顯的抑制作用，說(shuō)明CFS的抑菌活性不是由有機(jī)酸引起的，仍然存在其他的抑菌物質(zhì)。

經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理后的L.paracaseiQ-1-4發(fā)酵上清液抑菌能力比未處理的CFS低，但還存在較強(qiáng)的抑菌作用，從而說(shuō)明乳酸菌發(fā)酵上清液中的過(guò)氧化氫不是主要的抑菌物質(zhì)，還存在其它的物質(zhì)抑制指示菌。

2.3.2蛋白酶對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

為了確定抑菌物質(zhì)的性質(zhì)，用蛋白酶K、溶菌酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶處理CFS，測(cè)定酶處理前后對(duì)指示菌B.subtilisCGM CC 1（B）63501的抑菌活性變化，結(jié)果如表5所示。

表5　蛋白酶對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

由表5可以看出，L.paracaseiQ-1-4經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶處理之后對(duì)指示菌B.subtilisCGMCC1（B）63501的抑菌活性顯著下降，但仍然具有較強(qiáng)的抑菌作用，而經(jīng)過(guò)溶菌酶處理之后抑菌活性沒有變化，說(shuō)明該抗菌物質(zhì)中含有蛋白類物質(zhì)或肽類物質(zhì)。仍具有抑菌活性的原因可能是菌株Q-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)不僅僅含有蛋白類物質(zhì)，還有胞外多糖等其他具有抑菌效果的代謝產(chǎn)物。，具體成分有待進(jìn)一步分析確定[18]。經(jīng)胰蛋白酶和胃蛋白酶處理之后抑菌活性下降最大，說(shuō)明L.paracaseiQ-1-4對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶最敏感，而在人體腸道內(nèi)又存在胰蛋白酶和胃蛋白酶，所以在人體內(nèi)可被消化吸收而無(wú)殘留，可作為安全放心的食品防腐劑得以應(yīng)用。

2.4　 L.paracasei Q-1-4的抑菌動(dòng)力學(xué)曲線

圖4　 L.paracasei Q-1-4生長(zhǎng)曲線及抑菌活性

目前，細(xì)菌素產(chǎn)量和抑菌活性強(qiáng)弱通常是通過(guò)抑菌圈的直徑進(jìn)行衡量[25-26]。將L.paracaseiQ-1-4 37℃培養(yǎng)60 h，每隔2 h測(cè)定OD 600nm、pH值及CFS對(duì)B.subtilisCGM CC 1（B）63501抑菌活性，結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，L.paracaseiQ-1-4培養(yǎng)至4 h即進(jìn)入對(duì)數(shù)期，12～14 h后進(jìn)入到穩(wěn)定期，從整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中可以看出，L.paracaseiQ-1-4產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，最終pH值穩(wěn)定在3.9左右。L.paracaseiQ-1-4從對(duì)數(shù)期前期（6 h）開始，就有了抑菌活性，進(jìn)入穩(wěn)定期(12 h)后抑菌物質(zhì)產(chǎn)量持續(xù)增加，穩(wěn)定期后期(22 h)的抑菌物活性達(dá)到最高水平。故選取發(fā)酵22 h的發(fā)酵液作為后續(xù)研究對(duì)象。

2.5　 L.paracasei Q-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的特性

2.5.1pH穩(wěn)定性

將L.paracaseiQ-1-4產(chǎn)生的CFS的pH值調(diào)至2.0～6.0，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果如表7所示。

表7　抑菌物質(zhì)的pH穩(wěn)定性 mm

由表7可以看出，L.paracaseiQ-1-4產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在pH 2.0～5.0時(shí)對(duì)B.subtilisCGMCC1（B）63501有抑制作用，抑菌活性隨pH升高而逐漸降低。當(dāng)pH＞5.0時(shí)，對(duì)B.subtilisCGM CC 1（B）63501的抑制作用消失。因此，抑菌物質(zhì)對(duì)B.subtilisCGMCC1（B）63501的有效抑菌pH范圍為pH 2.0～5.0。該抑菌物質(zhì)在強(qiáng)酸條件下抑菌活性較強(qiáng)，這是由于乳酸菌素在低pH值時(shí)，乳酸菌對(duì)其吸附能力低，這種吸附作用隨著pH值降低而增強(qiáng)，因此，該抑菌物質(zhì)在低pH值時(shí)具有較高的抑菌活性，在高pH值時(shí)無(wú)抑菌活性[27]，所以它適用于偏酸性食品中。

2.5.2熱穩(wěn)定性

將不同pH的CFS分別在60，80，105，121℃下處理30 min，將未經(jīng)溫度處理的CFS作為對(duì)照，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表8所示。

表8　抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

由表8可以看出，L.paracaseiQ-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在同一處理溫度，不同pH下，隨著pH的升高，抑菌能力逐漸下降，當(dāng)pH值為2.0時(shí)各溫度環(huán)境下得抑菌圈直徑平均為38.44 mm,pH值為5.0時(shí)各溫度環(huán)境下抑菌圈直徑減小至平均18.01 mm，平均下降20.43 mm。不同溫度環(huán)境下的抑菌環(huán)直徑隨pH值升高而縮小的規(guī)律相近，且縮小幅度隨pH值升高而增加，pH值達(dá)到5時(shí)抑菌能力明顯下降。這可能是由于高pH環(huán)境使細(xì)菌素的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生了變化[27]，從而導(dǎo)致抑菌活性下降。L.paracaseiQ-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在同一pH值不同處理溫度下，隨著處理溫度的升高，抑菌活性逐漸降低。但總體來(lái)說(shuō)，降幅不大，各pH值條件下平均下降僅1.65 mm。該抑菌物質(zhì)對(duì)高溫表現(xiàn)出了相對(duì)良好的耐受性。耐高溫是該抑菌物質(zhì)的有利優(yōu)點(diǎn)，食品加工高溫處理時(shí)，其抑菌活性不受影響，故在食品加工中可得到廣泛的應(yīng)用。

2.5.3抑菌物質(zhì)的紫外線敏感性

將L.paracaseiQ-1-4的CFS在40W的紫外燈下將距離40 cm分別輻照不同時(shí)間的抑菌物質(zhì)活性如表9所示。

表9　抑菌物質(zhì)對(duì)紫外線的敏感性

由表9可以看出，經(jīng)紫外線輻照不同時(shí)間的抑菌物質(zhì)的抑菌活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異，說(shuō)明，L.paracaseiQ-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)紫外線不敏感。由于有些食品防腐劑不耐高溫高壓殺菌，便可以通過(guò)紫外殺菌的方式來(lái)達(dá)到滅菌的目的。該抑菌物質(zhì)對(duì)紫外有耐受性，故在食品防腐劑領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。

2.5.4有機(jī)溶劑對(duì)抑菌物質(zhì)的影響

L.paracaseiQ-1-4的CFS用甲醇、乙醇、丁醇、丙酮、氯仿處理后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果如表10所示。

由表10可以看出，上述有機(jī)溶劑對(duì)抑菌物質(zhì)的抑菌活性沒有明顯影響，說(shuō)明該抑菌物質(zhì)對(duì)有機(jī)溶劑具有良好的耐受性。

2.5.5表面活性劑對(duì)抑菌物質(zhì)的影響

L.paracaseiQ-1-4的CFS分別用質(zhì)量體積濃度為 1%的Tween 20、Tween 80、Tx-100、EDTA、SDS、Urea處理后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表11所示。

由表11可以看出，經(jīng) Tween 20、Tween 80、Tx-100、U rea處理的CFS對(duì)抑菌物質(zhì)的抑菌活性沒有明顯影響。添加SDS的抑菌物質(zhì)對(duì)B.subtilisCGM CC 1（B）63501的抑制作用明顯增強(qiáng)。這可能是由于SDS作為陰離子表面活性劑，通過(guò)與蛋白天然結(jié)構(gòu)中的內(nèi)部疏水區(qū)的配位作用使得蛋白結(jié)構(gòu)被打開，從而影響蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)[28]。L.paracaseiQ-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)與EDTA共同作用效果好于單一作用。對(duì)于革蘭氏陰性菌，EDTA起到外膜滲透劑的作用，絡(luò)合掉脂多糖維持其結(jié)構(gòu)所需的鈣離子，破壞其結(jié)構(gòu)；對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用則主要是由于EDTA與金屬離子結(jié)合[29]。

表10　有機(jī)溶劑對(duì)抑菌物質(zhì)的影響

表11　表面活性劑對(duì)抑菌物質(zhì)的影響

2.5.6金屬離子對(duì)抑菌物質(zhì)的影響

將L.paracaseiQ-1-4的CFS與溶解在50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）不同金屬離子（包括FeSO4，ZnSO4，CuSO4，mgSO4，BaC l2，CaC l2）溶液分別按 1:1體積混合。以未經(jīng)金屬離子處理的CFS及相同金屬離子濃度處理的M RS液體培養(yǎng)基為對(duì)照，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表12所示。

表12　金屬離子對(duì)抑菌物質(zhì)的影響

由表12可以看出，上述金屬離子對(duì)抑菌物質(zhì)的抑菌活性沒有明顯影響（P＞0.05），說(shuō)明對(duì)上述金屬離子有一定的耐受性。

2.6　抑菌物質(zhì)保藏的穩(wěn)定性

代謝產(chǎn)物在不同溫度下儲(chǔ)藏不同時(shí)間后對(duì)指示菌抑菌活性的變化結(jié)果表13。

由表13可以看出L.paracaseiQ-1-4在常溫、4℃、-20℃儲(chǔ)藏20 d后的CFS對(duì)B.subtilisCGMCC 1（B）63501的抑菌活性基本沒有明顯的變化。

表13　抑菌活性在儲(chǔ)藏過(guò)程中的變化

由表13可以看出，40 d后，抑菌活性略微降低一點(diǎn)，基本保持穩(wěn)定。60 d后，其活性均不同程度的降低，其中-20℃的損失最小，具體機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究?？梢奓.paracaseiQ-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在儲(chǔ)藏過(guò)程中對(duì)冷凍和冷藏有較好的耐受性，所以其在食品保藏方面具有一定的應(yīng)用潛力。

2.7　 L.paracasei Q-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌譜

通過(guò)以不同的革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌做指示菌，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，得到L.paracaseiQ-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌譜，結(jié)果如表14所示。

表14　Q-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌譜

由表14可以得出，L.paracaseiQ-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)所選的指示菌均顯示了較強(qiáng)的抑菌活性，其中對(duì)S.aureusCM CC（B）26112、E.coliATCC 25922、S.typhim uriumCMCC 50115、B.subtilisCGM CC 1（B）63501等顯示了很強(qiáng)的抑菌活性，抑菌圈直徑16 mm以上；對(duì)B.cerecusCGMCC1.1686、G.stearotherm ophilusGM CC 1.1923等顯示了較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌圈直徑13 mm以上。由此可知，L.paracaseiQ-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌譜較廣，對(duì)包括食品腐敗菌和致病菌在內(nèi)的許多革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌均有抑制作用，這使得該抑菌物質(zhì)有著廣闊的開發(fā)潛力。目前作為防腐劑應(yīng)用于食品中的N isin也只抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，1999:214-222.對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母菌抑制效果不好[30]?？梢?，由L.paracaseiQ-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在應(yīng)用前景上比N isin更廣闊。

3　結(jié)論

通過(guò)采用雙層瓊脂平板擴(kuò)散法，從分離自內(nèi)蒙古牧區(qū)手工乳制品的8株乳酸桿菌中篩選出抑菌效果較好的一菌株為Q-1-3，并通過(guò)分子學(xué)鑒定認(rèn)定該菌株為L(zhǎng).paracasei。將L.paracaseiQ-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)經(jīng)排酸、排過(guò)氧化氫后對(duì)B.subtilisCGM CC（B）63501仍具有明顯的抑制作用，但經(jīng)過(guò)不同蛋白酶處理后，抑菌活性在不同程度上有所下降，抑菌物質(zhì)中含有蛋白類物質(zhì)。L.paracaseiQ-1-4對(duì)指示菌的抑制作用來(lái)自其代謝產(chǎn)物，且在培養(yǎng)至6 h時(shí)開始具有抑菌活性，22 h左右達(dá)到最高。所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)B.subtilisCGM CC（B）63501作用方式是抑菌而非殺菌，抑菌譜較廣。L.paracaseiQ-1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在pH 2.0～5.0范圍內(nèi)對(duì)B.subtilisCGMCC（B）63501有抑制作用。在此pH范圍內(nèi)抑菌物質(zhì)對(duì)熱有耐受性，對(duì)紫外不敏感，耐儲(chǔ)藏，有機(jī)溶劑、金屬離子、表面活性劑對(duì)其影響不顯著，但與SDS和EDTA共同作用效果好于單一作用，且對(duì)指示菌的作用方式為抑制其生長(zhǎng)。

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