黃 滔，曹玉祥，張志堅(jiān)，周興路，魏慧君，吳志浩

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；3.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 肺癌研究所，天津 300052；4.皖南醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；5.皖南醫(yī)學(xué)院 活性生物大分子研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241002；6.皖南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

DNA甲基化是哺乳動(dòng)物基因組中最常見的表觀遺傳修飾，主要由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化來(lái)實(shí)現(xiàn)[1]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)是人體內(nèi)存在的最重要的甲基轉(zhuǎn)移酶，起著維持甲基化的作用[2]。DNMT1是DNMTs的一個(gè)重要亞型，編碼1495個(gè)氨基酸，其羥基端是保守的催化甲基化反應(yīng)結(jié)合域。DNMT1在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，如白血病[3]、非小細(xì)胞肺癌[4]、子宮內(nèi)膜癌[5]等，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥和預(yù)后有著緊密聯(lián)系，可被選作腫瘤去甲基化治療的靶點(diǎn)[6]。目前關(guān)于調(diào)控DNMT1的分子機(jī)制和生物學(xué)意義的研究較少，因此克隆DNMT1基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體為深入研究其調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)意義奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM 培養(yǎng)基 (HyClone 公司);pGL3-Basic 質(zhì)粒、質(zhì)粒小量提取試劑盒 (Promega公司);Polyjet (恩博生物公司);限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ和KpnⅠ (NEW ENGLAND BioLabs公司);T4 DNA連接酶 (TaKaRa 公司);細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)；E.coli DH5α Competent Cells (TaKaRa公司);PCR產(chǎn)物純化試劑盒(天根公司產(chǎn)品)，A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞基因組DNA的提取 由實(shí)驗(yàn)室凍存的A549細(xì)胞復(fù)蘇后，利用細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取A549基因組DNA，利用分光光度計(jì)檢測(cè)器檢測(cè)提取DNA的濃度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度和完整度。

1.2.2 DNMT1基因啟動(dòng)子克隆 在UCSC Genome Browser網(wǎng)站上查找出DNMT1基因啟動(dòng)子序列，根據(jù)序列利用Oligo 7設(shè)計(jì)出上游和下游引物，加上KpnⅠ和XhoⅠ 酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。上游引物：5′-GGGGTACCTGCTGTCATATCCAAGAAATCATTGCC-3′(下劃線為KpnⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物：5′-TTTCTCGAGGATGTACCAAACGGAGAGAGGCGATAC-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 3 min，變性94℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 2 min，延伸72℃ 5 min，共30循環(huán)，10℃保溫。

1.2.3 熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ對(duì)PCR純化產(chǎn)物和pGL3-Basic質(zhì)粒進(jìn)行酶切20 h和5 h，酶切完成后用純化試劑盒進(jìn)行純化，分別測(cè)出其濃度，按啟動(dòng)子片段：pGL3-Basic 載體為3∶1的摩爾比進(jìn)行連接，用T4 DNA連接酶連接5 h。將30 μL的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到100 μL的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并經(jīng)含Ampicillin 的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑出10個(gè)單菌落，進(jìn)行菌落PCR，篩選出1個(gè)陽(yáng)性菌落，再經(jīng)過含Ampicillin 的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取后，酶切鑒定和測(cè)序鑒定。

1.2.4 啟動(dòng)子活性檢測(cè) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H1299細(xì)胞均勻接種于細(xì)胞培養(yǎng)12孔板中，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)70%左右時(shí)將pGL3-proDNMT1-luc重組質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-CMV-luc進(jìn)行共轉(zhuǎn)，設(shè)立一個(gè)pGL3-Basic 質(zhì)?？瞻讓?duì)照，轉(zhuǎn)染48 h后饑餓過夜收樣后利用雙熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)螢火蟲和海腎熒光素酶活性。每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05說(shuō)明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNMT1啟動(dòng)子目的片段的PCR擴(kuò)增 用提取出來(lái)的人非小細(xì)胞肺癌A549基因組DNA為模板，用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果顯示與設(shè)計(jì)的啟動(dòng)子目的片段長(zhǎng)度一致，并呈現(xiàn)出一條特異性條帶(圖1)。

圖1 DNMT1啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖

2.2 DNMT1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體的菌落PCR鑒定 將大量擴(kuò)增出的片段進(jìn)行純化，將純化后的產(chǎn)物和pGL3-Basic質(zhì)粒分別行雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化。選取單個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增出片段長(zhǎng)度與設(shè)計(jì)的長(zhǎng)度一致，初步鑒定了DNMT1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建成功(圖2)。

圖2 DNMT1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體的菌落PCR鑒定圖

2.3 DNMT1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體的雙酶切鑒定 將挑出的陽(yáng)性單個(gè)菌落經(jīng)過液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和KpnⅠ進(jìn)行雙酶切，用1%的瓊脂糖凝膠將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳。結(jié)果顯示共出現(xiàn)2條帶，4818 bp出現(xiàn)的為載體片段，1643 bp出現(xiàn)的為目的片段。說(shuō)明目的片段在載體上插入成功(圖3)。

圖3 重組質(zhì)粒酶切后瓊脂糖膠電泳圖

2.4 DNMT1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè) 在12孔板中接種H1299細(xì)胞，以pGL3-Basic質(zhì)粒作為對(duì)照，轉(zhuǎn)染pGL3-proDNMT1-luc重組質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-CMV-luc，收樣后用Promega公司的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pGL3 -proDNMT1-luc的實(shí)驗(yàn)組與轉(zhuǎn)染pGL3-Basic-luc的對(duì)照組相比熒光量升高，對(duì)照組(0.1533±0.00548)和實(shí)驗(yàn)組(2.850±0.06481)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=41.46，P=0.0006)，因此可見構(gòu)建的DNMT1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體具有啟動(dòng)子活性(圖4)。

圖4 DNMT1啟動(dòng)子活性檢測(cè)

3 討論

報(bào)告基因是研究基因表達(dá)調(diào)控和基因工程的重要手段之一，其中雙熒光素酶報(bào)告基因應(yīng)用較廣泛。熒光素酶的表達(dá)量與熒光的強(qiáng)度相關(guān)，可作為真核細(xì)胞中基因表達(dá)量及啟動(dòng)子活性的測(cè)定手段，其中常用的報(bào)告基因載體為pGL3-Basic 載體[7]。

哺乳動(dòng)物的基因組甲基化主要由5個(gè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1、DNMT2、DNMT3A/3B和DNMTL)催化。其中DNMT1甲基化DNA復(fù)制后產(chǎn)生的半甲基化位點(diǎn)，使特定的表觀遺傳標(biāo)記得以維持。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,DNMT1與細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化以及腫瘤細(xì)胞的存活有著密切關(guān)系。DNMT1還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和腫瘤抑制基因的能力，以及通過p21和p53的高甲基化引發(fā)肺干細(xì)胞的增殖[8-10]。另外，DNMT1與基因啟動(dòng)子結(jié)合后可調(diào)節(jié)下游途徑，如wnt/β-catenin。同時(shí)，DNMT1還影響胚胎干細(xì)胞和體細(xì)胞中的微衛(wèi)星的穩(wěn)定性[11-12]。我們通過DNMT1啟動(dòng)子克隆、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告基因載體，對(duì)深入研究DNMT1 的分子機(jī)制和DNMT1在腫瘤細(xì)胞中的作用及其相關(guān)機(jī)制有著重要作用；同時(shí)，對(duì)相應(yīng)的靶向藥物的開發(fā)和提高臨床療效具有重要的臨床意義。

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