閆 明，馮紅超，許 華，張 偉，李麗艷

(1.河北省眼科醫(yī)院口腔頜面外科，河北邢臺 054000；2.貴州省貴陽市口腔醫(yī)院口腔頜面外科 550000；河北省眼科醫(yī)院：3.口腔內科；4.眼外傷科；5.科教科，河北邢臺 054000)

實體腫瘤在生長和血行轉移過程中，必須有血液供應。有研究者早在1971年提出腫瘤的血管生成理論[1]，此理論認為腫瘤血管的生成是促進腫瘤生長的一個重要因素。隨后，該理論成為一個研究熱點，一直被研究者認為是腫瘤獲得血液供應的唯一途徑。國外學者在1999年研究葡萄膜黑色素瘤時，發(fā)現了一種新的腫瘤供血微循環(huán)結構，此結構由腫瘤細胞圍成無內皮細胞參與的管道結構，此管道功能與血管相同，將這種新結構命名為擬血管生成(VM)[2]。VM結構與經典的腫瘤血管生成不同，后經國內外多個研究證實，VM存在于多種腫瘤中，例如肝癌、前列腺癌、乳腺癌等[1]，亦包括口腔鱗狀細胞癌(OSCC)。OSCC是一類嚴重危害人類健康的惡性腫瘤[3]，占口腔惡性腫瘤的80%，在頭頸鱗癌(HNSCC)中也占較大比例，病死率也較高。當前治療手段是手術切除病灶，但其有著較高的術后5年復發(fā)率[4]，因此研究OSCC的血液供應模式，找到有效的抗血管措施就顯得尤為重要。OSCC中是否存在VM尚不清楚。本研究使用特殊組織化學和免疫組織化學結合的雙重染色技術證實了OSCC中存在VM，并進一步探討了VM的生物學行為及其存在的臨床意義，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院口腔頜面外科及河北省眼科醫(yī)院口腔頜面外科2013年2月至2016年9月收治的并經病理證實的42例OSCC患者，同時收集其經手術切除、并經甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋的組織標本。其中男34例，女8例；年齡41～74歲，中位年齡53歲；發(fā)生于舌者26例，發(fā)生于頰部者9例，發(fā)生于牙齦者4例，發(fā)生于其他部位者(包括腭、口底)3例；按病理分級劃分，Ⅰ級7例，Ⅱ級20例，Ⅲ級15例；正常黏膜7例。

1.2儀器與試劑 Mouse anti-CD31鼠抗人CD31單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司，編號：ZM-0044)；PV-9000二步法檢測系統(tǒng)(北京中杉金橋生物技術有限公司，編號：PV-9000-3)；通用型SP系列工作液試劑盒(SP-9000，北京中杉金橋生物技術有限公司)；AB-PAS染色試劑盒(上海源葉生物技術開發(fā)有限公司)；二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，編號：zsZLI-9031)。

1.3方法 病理切片的脫蠟、水化、抗原修復：將切片置于檸檬酸緩沖溶液(0.01 mol/L，pH=6.0)熱修復專用容器中，高壓鍋中放水煮沸，后噴霧2 min取出。每張標本切片滴加1滴一抗(anti-CD31，1∶100)，置于4 ℃冰箱過夜孵育。次日將孵育完成的切片取出，冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液(PBS)對每個切片沖洗3次，每次3 min。每張標本切片滴加1滴聚合物增強劑，37 ℃孵育20 min；再用PBS沖洗3次，每次3 min。每張標本切片滴加1滴辣根酶標記的羊抗兔/小鼠IgG聚合物，37 ℃孵育30 min，之后用PBS液沖洗3次，每次3 min。DAB顯色約5～8 min，顯微鏡下觀察到血管內皮顯色后，立即使用自來水沖洗3 min終止顯色反應。使用0.5%的過碘酸溶液將切片浸泡還原8～10 min。使用流水沖洗3 min，將其置入Schiff液中，避光進行反應約13 min。之后用蒸餾水反復沖洗3次，每次1 min，再用自來水沖洗5 min。蘇木素淺染細胞核1～2 min，再次使用自來水沖洗終止染色反應。鹽酸酒精分化后，自來水返藍。常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠將標本封片。嚴格控制所用試劑應用條件，采用腎臟組織切片作為過碘酸雪夫染色(PAS)陽性片，PBS為陰性對照；采用已知的OSCC作為CD31的陽性片，PBS為陰性對照。

1.4結果判定

1.4.1陽性結果判定 CD31陽性結果為相應部位呈棕黃色顆粒著色，主要位于細胞膜；PAS陽性部位為基底膜，相應部位呈淡粉色著色。

1.4.2腫瘤微血管密度(MVD)計數標準與方法 MVD參考文獻[5]的方法：棕黃或棕褐色的內皮細胞團、如分界清楚則作為一個血管計數。10×10倍視野下掃視整個切片，尋找3個高血管密度區(qū)，換成10×40倍視野，計微血管個數。取平均數，計算MVD值(個/單位面積)，反映新血管生成密度。

1.4.3VM的判斷標準 參考文獻[2]的方法。VM的形態(tài)學和生理特征：(1)腫瘤細胞組成了管壁；(2)管壁結構無內皮細胞，PAS染色陽性物質將管壁結構與其余腫瘤組織分開；(3)管腔內有紅細胞；(4)VM周圍腫瘤壞死現象很少見到；(5)免疫組織化學染色的內皮特異標記(CD31、CD34等)呈陰性反應；(6)良性腫瘤及低侵襲性腫瘤中少見，主要被發(fā)現于高侵襲性腫瘤中。

1.5統(tǒng)計學處理 使用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件包對數據進行分析。計數資料采用百分數表示，組間比較采用χ2檢驗。等級資料的組間比較采用非參數的秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1染色結果 經過了CD31、PAS雙染的42例OSCC患者石蠟切片，經光鏡觀察，其中有15例(35.71%)中存在典型的VM。內皮構成的血管在光鏡下顯示為：由CD31染色陽性的內皮圍成管腔樣或網狀結構，PAS染色的基質存在于腫瘤與管壁間。與典型的內皮血管不同的是，VM直接由腫瘤細胞圍成管道樣結構，管道中可見紅細胞。CD31染色陽性的物質不存在于此結構中，這說明了此結構無內皮細胞參與構成。PAS陽性物質可連續(xù)或者不連續(xù)的存在于紅細胞與腫瘤細胞之間。VM的另一種結構方式也可在本研究中觀察到：PAS染色陽性的物質呈條索狀或網狀。在VM結構周圍無壞死腫瘤細胞、炎性細胞。其中，另外一種重要的陽性管道結構——淋巴管的顯微鏡下形態(tài)特點是管腔較大，很不規(guī)則，由連續(xù)的單層內皮細胞圍成。內皮細胞外無基底膜，偶見有內皮細胞連接處。

2.2OSCC中VM與臨床病理資料的關系 OSCC中VM與性別、年齡、腫瘤部位等無明顯相關性(P>0.05)，腫瘤直徑≥1.5 cm的VM陽性率(38.23%)高于腫瘤直徑<1.5 cm組的陽性率(25.00%)，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；無壞死組VM陽性率(41.37%)雖然高于有壞死組陽性率(23.07%)，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3OSCC中VM與病理分級的關系 病理分級為Ⅰ級的患者中有1例VM生成[14.28%(1/7)]，Ⅱ級患者中有6例VM生成[30.00%(6/20)]；Ⅲ級患者中有8例VM生成[53.33%(8/15)]。秩和檢驗結果提示，病理分級惡性程度越高，VM陽性率也越高，差異具有統(tǒng)計學意義(Z=2.193，P=0.028)。

2.4OSCC中VM與頸淋巴結轉移的關系 在16例頸淋巴結轉移患者中，VM陽性11例；在27例無淋巴結轉移的患者中，VM陽性5例。經過統(tǒng)計學分析，OSCC發(fā)生頸淋巴結轉移的患者其VM陽性率更高，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=12.286，P<0.01)。

表1 OSCC中VM與臨床病理資料的關系(n)

2.5OSCC中VM與MVD的關系 OSCC中VM陽性組的MVD值(44.20±11.42)高于VM陰性組的MVD值(36.25±9.27)，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.333)。

3 討 論

3.1OSCC的臨床病理特征 42例OSCC患者中男∶女為4.25∶1，與大多數文獻報道的男性發(fā)病率高于女性符合[4]。發(fā)生部位以舌多見，其次為頰、牙齦，其他部位亦有發(fā)病者，例如腭、口底，但均少見；OSCC患者易發(fā)生頸淋巴結轉移，42例中有16例發(fā)生頸淋巴結轉移；其與臨床病理特征及免疫組織化學染色結果與文獻[5]報道一致。

3.2OSCC中VM的形態(tài)特征 經過CD31、PAS雙染后，光鏡下可見腫瘤細胞組成了管道樣結構存在于OSCC標本中，此結構無內皮細胞參與，管腔與內皮性血管相通，紅細胞存在于此結構中。CD31即血小板-內皮細胞黏附分子-1(PECAM-1)，是一種表達于血管內皮的連接分子，其在免疫組織化學中的作用是標記血管，是內皮依賴性血管存在的標志。VM結構無內皮參與，CD31染色陰性，為了鑒別VM與內皮性血管，其在本研究中用來標記腫瘤內皮性血管。結合HE染色鏡下觀察，本研究發(fā)現，在部分OSCC中存在PAS陽性，而構成這些管道的細胞anti-CD31抗體染色陰性，部分管道內有紅細胞的存在，說明構成這種管道樣結構的非內皮細胞而可能是口腔鱗癌細胞，光鏡下觀察符合定義的VM結構[6]，與文獻[7-8]在晚期卵巢惡性腫瘤組織及在前列腺癌中發(fā)現的VM結構一致。這表明OSCC中也存在VM。

PAS主要表達于纖維結締組織，VM結構中其作用是分隔腫瘤細胞與紅細胞，在正常內皮性血管中則構成基底。本研究發(fā)現，PAS陽性物質是VM組成的一部分，且VM腔內也發(fā)現有PAS染色陽性物質，其來源可能是腫瘤細胞分泌。

有研究發(fā)現，很多黑色素瘤體積很大，卻并沒有出現壞死現象[2]。LUO等[2]研究卵巢癌時發(fā)現，有VM結構的腫瘤組織壞死很少或者沒有壞死，而沒有VM結構的則有明顯壞死。本研究只得出了有VM組壞死率低于無VM組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，可能原因為VM為腫瘤組織提供了血供，使腫瘤發(fā)生壞死的可能性降低。亦有可能是樣本量不足，異質性大所造成，此方面本課題組將在今后做深入研究。

有研究者發(fā)現使用微循環(huán)注射熒光染料進管腔后，染料播散至整個腫瘤組織[9-10]，FRANCESCONE等[6]構建的WIBC-9荷瘤鼠模型都證明了VM是具有功能的管道，其作用是聯通內皮性血管，為腫瘤供血。本研究使用了MVD計數方法，按照有無VM分為兩組，兩組結果的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這可能與樣本數量少有關，無法證明VM為一種功能性管道。

3.3OSCC中VM的生物學意義 本次研究發(fā)現VM管腔內有紅細胞。姚伶俐等[11]在人前列腺癌中發(fā)現VM結構存在紅細胞，表明VM作為一種特殊的微循環(huán)結構為腫瘤提供血供。腫瘤的生長需要血液供應，當發(fā)生缺氧時可以誘導VM，否則腫瘤細胞會因為缺血缺氧發(fā)生壞死。這也解釋了VM中的腫瘤內少有壞死現象的出現。本研究同時發(fā)現，VM為OSCC的頸淋巴結轉移提供了途徑，有頸淋巴結轉移患者VM陽性率高于無淋巴結轉移患者(P<0.05)。因此VM的存在對OSCC是否發(fā)生頸淋巴結轉移有著重要意義。

綜上所述，腫瘤中有無VM結構，對腫瘤的治療效果影響較大。當前對VM的診斷無金標準，只能通過雙染觀察其是否符合VM特征，因此在普通病理學檢查上通過PAS、CD31雙染進行檢測其結構，可制訂出針對腫瘤治療更詳盡的策略及更準確的預后評估，并對選擇手術切除和(或)血管栓塞治療的適應證提供客觀依據。

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