吳帥帥， 喬小放， 趙紅梅， 王曉科， 王海亮， 于 翔， 劉 軍

膠質(zhì)瘤(glioma)是指上皮組織來(lái)源的腫瘤，是最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤[1]，成人中的發(fā)病率為8/10萬(wàn)。依據(jù)WHO分級(jí)系統(tǒng)，其分為WHOⅠ～Ⅳ級(jí)，Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)屬于低級(jí)別膠質(zhì)瘤，Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)屬于高級(jí)別膠質(zhì)瘤，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastomamultiforme，GBM)是惡性程度最高的高級(jí)別膠質(zhì)瘤。臨床表明，手術(shù)治療是腦膠質(zhì)瘤的首選方法，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤浸潤(rùn)生長(zhǎng)，與腦組織界限不清等特點(diǎn)，造成外科手術(shù)難以全部切除。加上惡性腦膠質(zhì)瘤對(duì)放化療的治療不是很敏感，因此，為了延長(zhǎng)患者生存期及改善遠(yuǎn)期生活質(zhì)量，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療需要其他輔助方案。本實(shí)驗(yàn)從生物治療方法出發(fā)，以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究白?xì)胞介素2(IL-2)激活的自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)對(duì)腦膠質(zhì)具有一定程度的殺傷作用，希望為今后進(jìn)一步研究提供有利依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 NK細(xì)胞分離與純化 細(xì)胞提取：采集靜脈血50 ml →肝素抗凝→PBS稀釋抗凝外周血→加10 ml淋巴細(xì)胞分離液，離心15 min →取界面層細(xì)胞→再次離心10 min →PBS洗滌液混勻、離心棄上清→重復(fù)洗滌細(xì)胞操作1次→將細(xì)胞用PBS懸浮，待用。

NK細(xì)胞純化：(1)將以上所得細(xì)胞→加入分離緩沖液和抗CD56免疫磁珠比例混合→避光孵育15 min→加入1 ml 的PBS磷酸緩沖液離心，去上清→ PBS緩沖液懸浮細(xì)胞，備用。(2)PBS磷酸緩沖液細(xì)胞→加入ACS磁場(chǎng)分離→收集分選的陰性細(xì)胞→加入RPMI 1640培養(yǎng)基1 ml→分選的CD3-CD56+陽(yáng)性細(xì)胞→獲得NK細(xì)胞→培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，待用。

NK細(xì)胞培養(yǎng)：100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮NK 細(xì)胞→接種于適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶→置37 ℃，5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培→以培養(yǎng)24 h后的NK細(xì)胞作為備用細(xì)胞。

1.2 GBM選擇培養(yǎng)與鑒定 腫瘤組織取自吉林大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科膠質(zhì)瘤患者手術(shù)切除新鮮病理組織，術(shù)后病理報(bào)告診斷為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，WHO分級(jí)Ⅳ級(jí)。免疫組化染色結(jié)果：Olig-2(+)、EMA(弱+)、GFAP(+)、S-100(+)、KI67(陽(yáng)性率20%)、IDH-1(-)、CK(AE1/AE3)(-)。

GBM培養(yǎng)方法參考Parney 等[2]實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。無(wú)菌條件取腫瘤組織塊約10 g→高壓滅菌分塊后0.25%胰蛋白酶消化→充分消化15 min成單個(gè)細(xì)胞→加含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中止、濾過(guò)→2000 r/min，離心5 min，棄上清→取沉淀細(xì)胞，以每毫升3×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于培養(yǎng)瓶→無(wú)菌37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h→取貼壁細(xì)胞→無(wú)菌PBS沖洗細(xì)胞2～3次，棄不合格細(xì)胞→再次加胰蛋白酶和培養(yǎng)基，成單細(xì)胞懸液→取懸液接種在新的培養(yǎng)瓶接種→無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、備用。

經(jīng)培養(yǎng)的GBM經(jīng)HE染色顯示：細(xì)胞呈分化差形態(tài)多樣的不規(guī)則形或星形細(xì)胞，細(xì)胞分化差、大小不一，細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜，核異型性明顯，核分裂象多見(jiàn)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示Olig-2(+)、EMA(弱+)、GFAP(+)、S-100(+)、KI67(陽(yáng)性率20%)與新鮮腫瘤組織大致相似。

1.3 小鼠模型 裸鼠分組：BALB/c裸鼠無(wú)菌環(huán)境下飼養(yǎng)→隨機(jī)分組，每組6只(A、B、C、D、E、F、G、H組)→A：無(wú)菌裸鼠對(duì)照組；B：體內(nèi)移植GBM組織組；C：體內(nèi)注射IL-2組；D：體內(nèi)注射NK細(xì)胞組；E：同時(shí)移植GBM組織和NK細(xì)胞組；F：同時(shí)移植IL-2和NK細(xì)胞組；G：GBM組織、NK細(xì)胞和IL-2移植組。

建立動(dòng)物模型：(1)取培養(yǎng)的GBM組織→胰蛋白酶消化、離心→無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基→GBM細(xì)胞的懸液→微量注射器將0.1 ml GBM細(xì)胞懸液→皮下注射于BALB/c裸鼠背部皮下。(2)取純化的NK細(xì)胞懸液→無(wú)血清培養(yǎng)基中計(jì)數(shù)→配制細(xì)胞的懸液→微量注射器0.2 ml NK細(xì)胞懸液→尾靜脈注射于BALB/c裸鼠體內(nèi)。(3)取0.2 ml IL-2→微量注射器經(jīng)尾靜脈注射裸鼠體內(nèi)。經(jīng)尾靜脈注射IL-2、NK細(xì)胞和皮下注射GBM同一天進(jìn)行，且先注射GBM組織懸液。

腫瘤組織生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)：自腫瘤組織、NK細(xì)胞與IL-2移植之日起，每天密切觀察裸鼠生長(zhǎng)情況及是否體內(nèi)成瘤生長(zhǎng)。記錄裸鼠體內(nèi)開(kāi)始產(chǎn)生瘤體時(shí)間，每日測(cè)量腫瘤組織的最大長(zhǎng)徑(mm)與最大寬度(mm)，分別記為α、β，腫瘤體積計(jì)算公式：V=αβ2/2(mm3)[3]。腫瘤出現(xiàn)后21 d處死帶瘤裸鼠，解剖裸鼠取完整腫瘤組織，測(cè)量腫瘤重量[4]。

腫瘤組織病理：取裸鼠腫瘤組織HE染色，觀察病理組織細(xì)胞形態(tài)，行免疫組化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)行小樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)裸鼠生長(zhǎng)情況及成瘤情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：各組實(shí)驗(yàn)裸鼠無(wú)非正常死亡。裸鼠成瘤情況：B組(體內(nèi)移植GBM組)；E組(同時(shí)移植GBM組織和NK細(xì)胞組)；G組(GBM組織、NK細(xì)胞和IL-2移植組)小鼠體內(nèi)有均瘤體產(chǎn)生(見(jiàn)表1)。

2.2 B組、E組與G組裸鼠首次出現(xiàn)瘤體時(shí)間情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：B組、 E組、G組、小鼠體內(nèi)有均瘤體產(chǎn)生，腫瘤出現(xiàn)時(shí)間為(8.91±1.42)d、(14.22±2.12)d、(17.56±1.89)d。B組與 E組相比，小鼠體內(nèi)注射NK細(xì)胞后成瘤時(shí)間延長(zhǎng)，二組比較有明顯差異。E組與G組相比，小鼠體內(nèi)注射IL-2后體內(nèi)成瘤時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)，具有明顯差異(見(jiàn)表2、表3)。

2.3 各成瘤裸鼠組體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：NK細(xì)胞能有效抑制膠質(zhì)瘤在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)。圖表顯示移植GBM組織后出現(xiàn)膠質(zhì)瘤的裸鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受NK細(xì)胞的抑制作用，且IL-2可以增強(qiáng)NK細(xì)胞抑制作用(見(jiàn)圖1)，橫軸表示瘤體出現(xiàn)時(shí)間(d)，縱軸表示瘤體體積(×100 mm3)。

2.4 B組、E組與G組裸鼠體內(nèi)腫瘤重量分析 實(shí)驗(yàn)表明：腫瘤出現(xiàn)21 d后，處死裸鼠取完整腫瘤組織，并分別稱重、計(jì)算瘤體重量。結(jié)果顯示：E組比B組小鼠體內(nèi)的腫瘤重量小，二組比較有明顯差異。G組比E組小鼠體內(nèi)腫瘤重量要小，兩組P<0.05，具有明顯差異(見(jiàn)表4、表5)。

表1 各組小鼠生長(zhǎng)及成瘤情況

表2 B組與E組小鼠出現(xiàn)瘤體時(shí)間

表3 E組與G組裸鼠出現(xiàn)瘤體時(shí)間

表4 B組與E組小鼠體內(nèi)腫瘤重量

表5 E組與G組小鼠體內(nèi)腫瘤重量

2.5 移植CBM組織裸鼠體內(nèi)腫瘤組織病理分析 腫瘤組織病理：結(jié)合免疫組化染色結(jié)果及形態(tài)學(xué)特征考慮膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。免疫組化染色結(jié)果：Olig-2(+)、EMA(弱+)、GFAP(+)、S-100(+)、KI67(陽(yáng)性率20%)、CK(AE1/AE3)(-)，考慮膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Ⅳ級(jí)(見(jiàn)圖2)。

圖1 B組、 E組、G組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)速度情況

圖2 腫瘤組織病理

3 討 論

GBM是星形細(xì)胞譜系惡性程度最高、侵襲性最強(qiáng)的彌漫性膠質(zhì)瘤[5]，占惡性原發(fā)性腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的45.2%，占所有膠質(zhì)瘤的54%[6]。由于GBM惡性度高細(xì)胞生長(zhǎng)快，侵襲腦組織嚴(yán)重，病程短等特點(diǎn)造成腦組織水腫、顱內(nèi)壓增高癥狀明顯，基本所有患者前期都會(huì)出現(xiàn)頭痛、惡心嘔吐、視物模糊等癥狀；隨著病情加重漸漸表現(xiàn)出精神改變或意識(shí)障礙。如果腫瘤進(jìn)一步浸潤(rùn)性破壞腦組織，患者出現(xiàn)不同程度的肢體癱瘓、偏身感覺(jué)障礙、感覺(jué)或運(yùn)動(dòng)性失語(yǔ)等，甚至引起腦出血及腦疝，直接危及患者生命。GBM的診療方式一直是研究的熱點(diǎn)，雖然手術(shù)、放療還是化療，都取得了相對(duì)發(fā)展，但臨床治療效果還是無(wú)法滿足患者及家屬的預(yù)期，中位生存期為15 m[7]，相對(duì)生存期僅為2 y的占13.7%[6]，5 y生存率低于5%[8]。因此，探究新型生物免疫治療的可能是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵性治療方法。

本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)人GBM細(xì)胞，將體外培養(yǎng)的GBM細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)移植，建立神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠移植模型并進(jìn)行免疫細(xì)胞治療(提取健康人體內(nèi)NK細(xì)胞同GBM細(xì)胞與IL-2共培養(yǎng))，觀察NK細(xì)胞對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型的治療作用。研究顯示：人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)，然后經(jīng)過(guò)移植小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)出的腫瘤組織，經(jīng)過(guò)病理分析基本一致，顯示了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)、傳代及神經(jīng)膠質(zhì)瘤分化的潛能；E、G組的裸鼠出現(xiàn)腫瘤時(shí)間比B組裸鼠的成瘤時(shí)間明顯變長(zhǎng)；裸鼠體內(nèi)腫瘤體積較B組裸鼠的明顯減小，說(shuō)明NK細(xì)胞具有抵抗GBM的生長(zhǎng)作用，同時(shí)也證明了IL-2能增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)GBM細(xì)胞增殖及生長(zhǎng)的抑制作用，在某種機(jī)制上減慢了腫瘤的生長(zhǎng)。資料顯示，Stupp等[9]將IL-2激活的人NK細(xì)胞注射神經(jīng)母細(xì)胞瘤的小鼠體內(nèi)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞可以進(jìn)入瘤體組織中，而且發(fā)現(xiàn)了體內(nèi)注射NK細(xì)胞的成瘤小鼠生長(zhǎng)時(shí)間較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)。

NK細(xì)胞是非特異性免疫細(xì)胞，不需要抗原致敏，可以直接殺死腫瘤和病毒感染的靶細(xì)胞。NK細(xì)胞表面存在抑制性殺傷受體，靶細(xì)胞表面存在人白細(xì)胞抗原I類分子(HLA-I)類分子，當(dāng)受體和此類分子結(jié)合時(shí)NK細(xì)胞的殺傷作用被抑制。當(dāng)NK細(xì)胞結(jié)合的細(xì)胞表面缺少HAL類分子時(shí)才表現(xiàn)出NK細(xì)胞的作用。IL-2是免疫系統(tǒng)中的一類細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能調(diào)控免疫細(xì)胞活性，也參與抗體反應(yīng)、造血和腫瘤監(jiān)視，但沒(méi)有直接殺死腫瘤的作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：IL-2激活的NK細(xì)胞對(duì)GBM抑制、殺傷效應(yīng)，可能是NK細(xì)胞抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面HLA-I類分子，從而誘發(fā)了其活性。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[9，10]，NK細(xì)胞存在協(xié)同效應(yīng)的活化機(jī)制，如在小鼠的LAK細(xì)胞上的NKG2D是一種潛在的協(xié)同刺激受體，認(rèn)為IL-2可通過(guò)促進(jìn)NKG2D的表達(dá)活化NK細(xì)胞，從而增強(qiáng)了NK細(xì)胞對(duì)GBM的抑制及殺傷作用。因此，目前IL-2激活的NK細(xì)胞的機(jī)制還不清楚，關(guān)于IL-2激活的NK細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤的殺傷作用還需進(jìn)一步研究，希望NK細(xì)胞成為治療腦膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵生物免疫療法。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)初步證明了NK細(xì)胞對(duì)GBM細(xì)胞的抑制殺傷作用，希望通過(guò)本篇研究能為腦膠質(zhì)瘤免疫療法的進(jìn)一步研究和治療提供方向和幫助。

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