吳呈霖 王梅芳 雷懷定

近50年來(lái)，肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年增加，已經(jīng)超過(guò)其他腫瘤，成為威脅人類(lèi)健康的“殺手之一”[1]。據(jù)人群統(tǒng)計(jì)學(xué)大數(shù)據(jù)顯示，在男性人群中，肺癌的發(fā)病率和死亡率占所有惡性腫瘤的第一位；在女性人群中，肺癌占據(jù)第二位[2]。目前肺癌的治療以手術(shù)為主，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，效果不佳[3]。因此，尋找更好的基因治療靶點(diǎn)，為臨床上肺癌患者提供新的治療思路，仍然具有十分重要的意義。

RNA干擾(shRNA)技術(shù)可以有效沉默基因表達(dá)，該過(guò)程主要通過(guò)雙鏈RNA(dsRNA)使目標(biāo)基因相應(yīng)的mRNA選擇性失活得以實(shí)現(xiàn)的[4]。shRNA干擾技術(shù)是通過(guò)短反義核酸鎖定細(xì)胞mRNA，從而實(shí)現(xiàn)其隨后的降解。其反過(guò)來(lái)又阻斷了該蛋白的進(jìn)一步表達(dá)/聚集，導(dǎo)致其水平下降，抑制基因表達(dá)[5]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，Survivin具有腫瘤特異性，只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細(xì)胞的分化增殖及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)Survivin基因在鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病發(fā)展過(guò)程中具有高表達(dá)的特性，并且與p53、bcl-2蛋白的表達(dá)具有相關(guān)性[6]。本文旨在探討shRNA干擾 Survivin質(zhì)粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖，凋亡和遷移的影響。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. 肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的培養(yǎng): 本實(shí)驗(yàn)以人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為實(shí)驗(yàn)材料。所有細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究院。細(xì)胞經(jīng)離心收集后，以2×104/cm2的密度將其種植于25×25 cm2的培養(yǎng)瓶中。加入含10%胎牛血清(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)的RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)，而后將細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2. 構(gòu)建shRNA干擾 Survivin慢病毒載體: sh RNA Survivin質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P公司合成，選擇pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro作為質(zhì)粒的克隆載體。shRNA干擾 Survivin載體病毒載體的克隆切入點(diǎn)是XhoI/BamHI，編號(hào)為ENST00000003424。經(jīng)過(guò)基因測(cè)序，從而證明序列的正確性。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1. 實(shí)驗(yàn)分組: 將A549細(xì)胞分成3組，即空白對(duì)照組，空白病毒載體對(duì)照組和shRNA干擾 Survivin慢病毒載體組?？瞻讓?duì)照組為未做任何處理的細(xì)胞組，空白病毒載體對(duì)照組是經(jīng)空白載體的慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組，shRNA干擾 Survivin組是由shRNA干擾 Survivin慢病毒的干擾載體構(gòu)建的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組。以ZsGreen為慢病毒熒光探針，用熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞慢病毒的轉(zhuǎn)染效率。

2. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè): 3組細(xì)胞在融合率達(dá)80%以上后，用0.25%胰蛋白酶消化后放入15 ml離心管中，加入1 ml的Trizol RNAiso，裂解細(xì)胞，提取RNA后根據(jù)Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR820A,Takara，日本)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA保存在4 ℃冰箱中備用。根據(jù)Takara熒光定量PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)的要求，采用20 μl的反應(yīng)體系，加入各樣品，進(jìn)行熒光定量PCR的檢測(cè)。采用FS2000系統(tǒng)對(duì)PCR進(jìn)行分析，反應(yīng)條件預(yù)設(shè)為預(yù)變性95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s， 40個(gè)循環(huán)。溶解曲線(xiàn)：95 ℃ 5 s； 60 ℃ 1 min。降溫： 50 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因GAPDH和表皮成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物小鼠抗波形蛋白(Vimentin)引物由上海生工公司生產(chǎn)，見(jiàn)表1。采用2-△△Ct的方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 目的基因的引物序列

3. Western-blot檢測(cè): 3組細(xì)胞處理后，加入1 ml RIPA細(xì)胞裂解液，各組細(xì)胞在冰上裂解30 min，收集入1.5 ml的離心管中，在預(yù)冷4 ℃的離心機(jī)中離心，預(yù)設(shè)：以離心半徑8 cm，5 000 r/min，離心5 min后提取上清，經(jīng)95 ℃煮沸后，收集蛋白備用。按照說(shuō)明書(shū)制備濃縮膠10 ml，分離膠20 ml。上樣后電泳分離，轉(zhuǎn)PVDF膜后孵育一抗，在4 ℃冰箱避光孵育過(guò)夜(>12 h)。Survivin一抗(ab76424, Abcom公司，中國(guó))經(jīng)一抗稀釋液1︰10 000稀釋后加入樣本離子膜。第2天用PBST稀釋液洗膜，重復(fù)3次，加用山羊抗小鼠IgG二抗(P-2771MP, ThermoFisher,中國(guó))經(jīng)二抗稀釋液1︰1 000稀釋后孵育二抗1.5 h，用PBST稀釋液洗膜，重復(fù)3次，而后用DAB顯影液處理樣本。Image J軟件分析蛋白條帶。

4. Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移: 將空白對(duì)照組，空白病毒載體組，shRNA干擾 Survivin載體病毒組等細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后收集，按照試劑盒(康寧Transwell小室3402，Costar)的說(shuō)明書(shū)，將基底膜的基質(zhì)原液放在冷藏冰箱(4 ℃)過(guò)夜融化，然后與預(yù)冷的無(wú)血清的RPMI-1640按照1︰3的比例配置侵襲上室凝膠液體，以每孔55 μl的量包被Transwell小室的上室，放置在37 ℃的孵育箱，2 h后使上室成膠。然后上室每孔接種200 μl不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，下室加入10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液500 μl。然后將Transwell板放置在37 ℃的孵育箱中培養(yǎng)24 h后用結(jié)晶紫染色。然后將Transwell板用倒置光學(xué)顯微鏡，拍照，并且進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

5. CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖: 將空白對(duì)照組，空白病毒載體組，shRNA干擾 Survivin載體病毒組等細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后收集，按照CCK-8試劑盒(CA1210,索萊寶，中國(guó))的說(shuō)明書(shū)，將3組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種在96孔板中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞以每孔5 000個(gè)/100 μl的接種量接種，72 h后每孔加入10 μl的CCK-8的試劑，放到37 ℃的孵育箱中培養(yǎng)2 h。然后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

6. AV-PI雙染檢測(cè)細(xì)胞的凋亡: 將空白對(duì)照組，空白病毒載體組，shRNA干擾 Survivin載體病毒組等細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后收集，按照AV-PI的試劑盒的說(shuō)明書(shū)(4830-01-1，深圳紐邦，中國(guó))檢測(cè)3組細(xì)胞的凋亡率。流式細(xì)胞儀分析各組樣本，計(jì)算各組的凋亡率,凋亡率的計(jì)算=(早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)。Annexin V+/PI-為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V+/PI+為晚期凋亡和壞死細(xì)胞，Annexin V-/PI-為具有正?；钚缘募?xì)胞。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、shRNA干擾 Survivin病毒載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

慢病毒轉(zhuǎn)染效率，見(jiàn)圖1。慢病毒滴度的檢測(cè)結(jié)果：shRNA干擾 Survivin病毒組的慢病毒的滴度為1×108TU/ml，這說(shuō)明慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)染效率。

圖1 shRNA干擾 Survivin載體病毒載體的轉(zhuǎn)染；注：用0.11 μl和0.033 μl慢病毒轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，慢病毒滴度的檢測(cè)結(jié)果：shRNA干擾 Survivin載體病毒組慢病毒的滴度為1×108 TU/ml

二、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組中透過(guò)分子篩的細(xì)胞數(shù)為(131.32±18.39，n=3)，空白載體病毒對(duì)照組中透過(guò)分子篩的細(xì)胞數(shù)為(142.11±14.02，n=3)，shRNA干擾 Survivin載體病毒組中透過(guò)分子篩的細(xì)胞數(shù)為(52.11±4.09，n=3)。三組之間比較具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=31.982，P<0.05)。其中shRNA干擾 Survivin載體病毒組和空白載體病毒組相比，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)說(shuō)明shRNA干擾 Survivin載體病毒組細(xì)胞的遷移比空白載體病毒組細(xì)胞數(shù)少，見(jiàn)圖2。

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移檢測(cè)結(jié)果；注：A：空白對(duì)照組；B：空白載體病毒對(duì)照組；C：shRNA Survivin慢病毒載體組

三、CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞的增殖率(%)為(60.34±1.24，n=3)，空白載體病毒對(duì)照組的增殖率(%)為(51.12±2.47，n=3)，shRNA干擾 Survivin載體病毒組的增殖率(%)為(24.27±3.11，n=3)，三組比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。shRNA干擾 Survivin載體病毒組與空白載體病毒對(duì)照組比較具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)提示shRNA干擾 Survivin載體病毒組細(xì)胞的增殖率比空白載體病毒對(duì)照組低，見(jiàn)圖3。

圖3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖(×100)

四、AV-PI檢測(cè)細(xì)胞的凋亡

AV-PI檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率(%)為(4.21±1.24，n=3)，空白載體病毒對(duì)照組的凋亡率(%)為(3.09±1.13，n=3)，shRNA干擾 Survivin載體病毒組的凋亡率(%)為(35.21±13.31，n=3)，三組比較具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。shRNA干擾 Survivin載體病毒組與空白載體病毒對(duì)照組比較具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。說(shuō)明shRNA干擾 Survivin載體病毒組細(xì)胞的凋亡率比空白載體病毒對(duì)照組要高，見(jiàn)圖4。

五、RT-qPCR和Western-Blot檢測(cè)各組的凋亡基因Caspase-3,Caspase-9的表達(dá)

shRNA干擾 Survivin載體病毒組與空白載體病毒組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=2.097，P=0.0219<0.05)。從mRNA水平上說(shuō)明shRNA干擾 Survivin載體病毒組中Caspase-3與空白載體病毒組相比，表達(dá)量降低，表明shRNA干擾 Survivin可以有效抑制凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)，從而可以抑制凋亡。shRNA干擾 Survivin載體病毒組與空白載體病毒組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。shRNA干擾 Survivin載體病毒組中Caspase-9與空白載體病毒組相比，前者表達(dá)量降低，表明shRNA干擾 Survivin可以有效抑制凋亡蛋白Caspase-9的表達(dá)，從而可以抑制凋亡。Western-Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，shRNA干擾 Survivin載體病毒組與空白載體病毒組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。shRNA干擾 Survivin載體病毒組中Caspase-3與空白載體病毒組相比，表達(dá)量降低，表明shRNA干擾 Survivin可以有效抑制凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)，從而可以抑制凋亡。shRNA干擾 Survivin載體病毒組與空白載體病毒組相比，shRNA干擾 Survivin載體病毒組中Caspase-9表達(dá)量降低(P<0.05)，表明shRNA干擾 Survivin可以有效抑制凋亡蛋白Caspase-9的表達(dá)，從而可以抑制凋亡，見(jiàn)圖5。

討 論

shRNA技術(shù)相較于siRNA技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)，具體優(yōu)勢(shì)在于shRNA技術(shù)可以穩(wěn)定的表達(dá)于細(xì)胞體系中，并且不會(huì)隨著細(xì)胞的不斷傳代，表達(dá)效價(jià)隨之降低[7]。shRNA技術(shù)可以更好的針對(duì)基因進(jìn)行沉默，可以使基因獲得更加穩(wěn)定。鑒于以上優(yōu)點(diǎn)。shRNA技術(shù)越來(lái)越引起大家的注意，為臨床上進(jìn)行基因治療提供了新的研究方法。唐益庭等[8]用shRNA下調(diào)泛素表達(dá)，探究shRNA對(duì)肺癌細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)shRNA可以抑制人肺癌H1299細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡。本研究采用shRNA技術(shù)，構(gòu)建shRNA干擾 Survivin病毒載體，從基因水平將Survivin基因沉默，抑制Survivin基因的表達(dá)，觀(guān)察了Survivin基因沉默后的腫瘤細(xì)胞的凋亡，遷移和增殖的水平。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，Survivin具有腫瘤特異性，只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織[9-10]。‘夢(mèng)澤等[11]采用survivin基因表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞A549和Hela S3細(xì)胞的影響進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)siRNA能有效沉默survivin基因在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究探討shRNA-Survivin基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響，旨在尋求新的基因治療方法，為臨床上肺癌的治療提供新的思路。

圖4 AV-PI檢測(cè)細(xì)胞的凋亡；注：A：空白對(duì)照組的凋亡檢測(cè)；B：空白載體病毒組的凋亡檢測(cè)；C：shRNA干擾 Survivin載體病毒組的凋亡檢測(cè)；D： 三組凋亡的檢測(cè)結(jié)果分析

圖5 RT-qPCR和Western-Blot檢測(cè)空白對(duì)照組，空白載體病毒組和shRNA干擾 Survivin載體病毒組的凋亡基因Caspase-3,Caspase-9的表達(dá)水平；注：A：Caspase-3基因的mRNA表達(dá)水平；B：Caspase-9基因的mRNA表達(dá)水平；C：Western-Blot檢測(cè)結(jié)果；D：Western-Blot檢測(cè)結(jié)果的蛋白相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果分析

Caspase家族是近年來(lái)細(xì)胞凋亡領(lǐng)域中分子生物學(xué)研究的重要發(fā)現(xiàn)之一，在凋亡的最后階段是通過(guò)Caspase家族的激活和表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。其中Caspase-3和Caspase-9是Caspase家族中與凋亡密切相關(guān)的蛋白酶[12-13]。郭曉東等[14]的研究表明Caspase-9蛋白酶與肝癌細(xì)胞的凋亡有密切聯(lián)系。本研究將Caspase-3和Caspase-9作為肺癌細(xì)胞凋亡的標(biāo)志蛋白，研究在shRNA作用下，其對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響。通過(guò)RT-qPCR方法檢測(cè)shRNA-Survivin對(duì)肺癌細(xì)胞中凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，shRNA-Survivin載體病毒組與空白載體病毒組相比，前者可以明顯提高肺癌細(xì)胞的凋亡率，由此可見(jiàn)shRNA-Survivin在肺癌細(xì)胞的凋亡中具有明顯的作用。另外通過(guò)蛋白水平Western-Blot檢查結(jié)果也表明了此種趨勢(shì)，進(jìn)一步證實(shí)了shRNA干擾 Survivin載體在肺癌細(xì)胞的凋亡中具有明顯促進(jìn)作用。

王俊鋼等[15-18]研究證實(shí)了非小細(xì)胞肺癌的遷移與小RNA有關(guān)，本研究進(jìn)一步利用Transwell的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)shRNA干擾 Survivin對(duì)肺癌細(xì)胞的遷移的作用。發(fā)現(xiàn)shRNA干擾 Survivin對(duì)肺癌細(xì)胞的遷移具有明顯的抑制作用。另外，本研究還利用CCK-8實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了肺癌腫瘤細(xì)胞的增殖，發(fā)現(xiàn)shRNA干擾 Survivin對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用。本研究利用AV-PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的凋亡，結(jié)果表明shRNA干擾 Survivin對(duì)肺癌細(xì)胞的過(guò)度凋亡也具有明顯增強(qiáng)作用。

然而本文結(jié)果，只是初步探討了shRNA干擾Survivin對(duì)肺癌細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)其可以有效的抑制肺癌細(xì)胞的遷移和增殖，并且提高其凋亡率，但是對(duì)其具體起作用的分子生物學(xué)機(jī)制并不完全明了，尚需進(jìn)一步的研究。shRNA干擾 Survivin可以有效的抑制肺癌細(xì)胞的遷移和增殖，并且提高其凋亡率，為臨床上肺癌的預(yù)防與治療提供了新的思路與方法。