亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        抑制miR-134治療大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)實(shí)驗(yàn)研究

        2018-08-20 04:42:52王小木賈瑞華姜瞾王津存夏峰
        關(guān)鍵詞:海馬癲癇

        王小木 賈瑞華 姜瞾 王津存 夏峰*

        (1空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,陜西 西安 710032; 2解放軍457醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北 武漢 430012)

        癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE)的年發(fā)病率為10/10萬~40/10萬,為神經(jīng)內(nèi)科中僅次于急性腦血管病的急危重癥。探索新的起效快、作用強(qiáng)的治療方法,成為神經(jīng)科臨床工作中亟待解決的難點(diǎn)問題。近年來研究發(fā)現(xiàn)微小核糖核酸(microRNAs, miRNAs)在癲癇的發(fā)生機(jī)制中扮演了重要角色[1-2]。其中微小核糖核酸-134(microRNA-134, miR-134)作為一種特異性的表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)的miRNA,主要參與神經(jīng)元微觀結(jié)構(gòu)的調(diào)控,如樹突棘的密度與長度等,進(jìn)而調(diào)控局部神經(jīng)回路的興奮性[3-5]。既往研究表明,在動(dòng)物癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)生過程中,海馬miR-134表達(dá)出現(xiàn)了明顯的上調(diào)[5]。結(jié)合其特異性的表達(dá)與生理功能,我們假設(shè):miR-134可能參與了癲癇持續(xù)狀態(tài)的發(fā)生,對其深入研究可能為癲癇持續(xù)狀態(tài)的治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。本研究首先構(gòu)建大鼠miR-134抑制慢病毒載體,再應(yīng)用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射建立大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型,觀察miR-134抑制對大鼠發(fā)作潛伏期,癲癇持續(xù)狀態(tài)時(shí)間,發(fā)作嚴(yán)重程度,腦電圖功率以及海馬神經(jīng)元凋亡的影響,以期闡明miR-134在癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)生中的作用。

        材料與方法

        一、構(gòu)建大鼠miR-134抑制慢病毒載體

        構(gòu)建并驗(yàn)證大鼠miR-134抑制慢病毒載體[6]。

        二、建立氯化鋰-匹羅卡品大鼠SE模型

        觀察miR-134抑制對大鼠發(fā)作潛伏期,癲癇持續(xù)狀態(tài)時(shí)間,發(fā)作嚴(yán)重程度,腦電功率以及海馬神經(jīng)元凋亡的影響。

        1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:雄性(Spraque-Dawley, SD)大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組,病毒組及對照病毒組。

        2.大鼠海馬立體定向注射及海馬腦電圖電極安裝:大鼠以10%的水合氯醛麻醉后固定于立體定位儀;以前囟作為參考點(diǎn),前點(diǎn):前囟后3.0 mm,偏右或偏左1.4 mm,深度3.0 mm;后點(diǎn):前囟后4.0 mm,偏右或偏左4.4 mm,深度3.2 mm。在相應(yīng)部位打開顱骨,利用微量注射器將3 L慢病毒注入海馬。放置海馬電極:前囟后3.0 mm,偏右或偏左2.0 mm,深度2.6 mm。參考電極置于雙眼連線與矢狀縫相交處。

        3.大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型的制備及腦電圖記錄:2 w后各組SD大鼠給予腹腔注射溴甲基東莨菪堿1 mg/kg;半小時(shí)后腹腔注射氯化鋰(130 mg/kg),24 h后腹腔注射匹羅卡品50 mg/kg。發(fā)作劇烈程度按Racine分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分,分級達(dá)Ⅳ級或以上者認(rèn)定為造模成功。大鼠出現(xiàn)SE后40 min給予地西泮5 mg/kg終止發(fā)作;記錄腦電圖并計(jì)算腦電總功率。

        4.免疫組織化學(xué):10%水合氯醛麻醉大鼠;經(jīng)左心室常規(guī)4%多聚甲醛灌注;取腦;腦組織置于4%多聚甲醛中固定8 h;置于40%蔗糖的磷酸緩沖溶液(phosphate buffer, PB)中,4 ℃存放,直至沉底。用冰凍切片機(jī)切成厚度為30 μm的薄片;進(jìn)行末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素脫氧尿嘧啶核苷酸缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated biotinylated deoxyuridine triphosphate, TUNEL)及神經(jīng)元核(neuronal Nuclei, NeuN)染色后。

        5.實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測慢病毒立體定向注射2 w后各組大鼠海馬miR-134表達(dá):各組大鼠總RNA提取后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以U6為內(nèi)參,進(jìn)行RT-PCR檢測。具體實(shí)驗(yàn)方法參照TaKaLa RR716試劑盒說明書。檢測所得數(shù)據(jù)通過2-△△CT法進(jìn)行相對定量。引物序列為:5'-GCGTACCAGAGGGAAAAAA-3',5'-TGGGCCACCTAGTCACCAA-3'。

        7.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程:如圖1所示。

        圖1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物流程

        Fig 1 Animal experiment process

        結(jié) 果

        一、各組大鼠腦電圖及發(fā)作潛伏期

        1.比較匹羅卡品注射后各組大鼠癲癇Ⅴ級發(fā)作發(fā)作潛伏期:各組大鼠從腹腔注射匹羅卡品開始監(jiān)測行為學(xué),記錄達(dá)到Ⅴ級發(fā)作的時(shí)間,生理鹽水組(100%, 5/5),對照病毒組(100%, 7/7),病毒組(72%, 8/11)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,病毒組潛伏期為(46.75±9.54)s,對照病毒組潛伏期(27.14±6.79)s,生理鹽水組潛伏期為(29.60±7.06)s,病毒組潛伏期比對照病毒組縮短,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01),對照病毒組與生理鹽水組潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)(圖2)。

        2.比較各組癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作時(shí)間,發(fā)作劇烈程度及腦電圖功率:病毒組(inhibiting miR-134)組、對照病毒組及生理鹽水組Racine評分無明顯差異(P> 0.05)(圖3);同生理鹽水組和對照病毒組相比,病毒組(inhibiting miR-134)組癲癇持續(xù)狀態(tài)持續(xù)時(shí)間縮短(P< 0.05),生理鹽水組和對照病毒組無明顯差異(P> 0.05)(圖4);計(jì)算腦電總功率,同生理鹽水組和對照病毒組相比,病毒組(inhibiting miR-134)組腦電總功率降低(P< 0.001)(圖5)。

        二、慢病毒立體定向注射后大鼠海馬miR-134的表達(dá)

        帶有紅色熒光蛋白的慢病毒立體定向注射于大鼠海馬2 w后,灌注,制備為30 μm腦片,利用熒光顯微鏡觀察。在海馬CA1、CA2及CA3區(qū)有紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞表達(dá)(圖6)。

        三、RT-PCR檢測慢病毒立體定向注射后各組大鼠海馬miR-134的表達(dá)

        立體定向注射慢病毒2 w后,正常對照組與對照病毒組miR-134表達(dá)無明顯差異(P> 0.05)。相對于正常組及對照病毒組大鼠,miR-134抑制病毒組(inhibiting miR-134組)大鼠海馬miR-134表達(dá)降低(圖7) (P< 0.001)。

        圖2 病毒組(Inhibiting miR-134)較生理鹽水組及對照病毒組Ⅴ級發(fā)作潛伏期延長

        Fig 2 Compared to the control group and NS group, the virus group had longer racine score Ⅴ lantency

        aP< 0.01,vsCont virus group and NS group.

        圖3 病毒組(Inhibiting miR-134)和生理鹽水組及對照病毒組發(fā)作強(qiáng)度無明顯差異

        Fig 3 No significant difference in seizure severity was showed among the control group, NS group and virus group.

        圖4 病毒組(Inhibiting miR-134)同生理鹽水組及對照病毒組相比,癲癇持續(xù)狀態(tài)時(shí)間縮短

        Fig 4 Compared to the control virus group, the virus group had shorter duration of SE

        bP< 0.05,vsCont virus group and NS group.

        圖5 病毒組(Inhibiting miR-134)同生理鹽水組及對照病毒組相比,腦電總功率降低

        Fig 5 Compared to the control virus group, the virus group had lower total EEG power

        cP<0.001,vsCont virus group and NS group.

        圖6 大鼠海馬紅色熒光蛋白表達(dá)

        Fig 6 The expression of red fluorescence protein in rat hippocampus at 2 w after virus injection

        圖7 RT-PCR檢測立體定向注射2 w后正常對照組、對照病毒組和miR-134抑制病毒組大鼠海馬miR-134表達(dá)水平

        Fig 7 Expression of miR-134 in virus group, contvirus group and normal cont group at 2 w after virus injection detected by RT-PCR

        cP< 0.001,vsCont virus group.

        四、NeuN染色及Tunel染色檢測癲癇持續(xù)狀態(tài)3 d后病毒組(inhibiting miR-134)和對照病毒組海馬損傷情況

        1.NeuN染色顯示癲癇持續(xù)狀態(tài)后3 d,病毒組(inhibiting miR-134)齒狀回(dentate gyrus, DG),CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元均較和對照病毒組增多(圖8~9)。

        2.Tunel染色顯示癲癇持續(xù)狀態(tài)后3 d,病毒組(inhibiting miR-134)DG、CA1及CA3區(qū)凋亡細(xì)胞較對照病毒組減少(圖10)。

        圖8 病毒組(Inhibiting miR-134)及對照病毒組海馬DG、CA1及CA3區(qū)NeuN染色

        Fig 8 NeuN staining in hippocampus (DG, CA1 and CA3) in virus group and cont virus group

        A: NeuN staining in hippocampus of cont virus group; B: NeuN staining in hippocampus of virus group; C: NeuN staining in DG of cont virus group; D: NeuN staining in DG of virus group; E: NeuN staining in CA1 of cont virus group; F: NeuN staining in CA1 of virus group; G: NeuN staining in CA3 of cont virus group; H: NeuN staining in CA3 of virus group.

        圖9 病毒組(Inhibiting miR-134)海馬DG, CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元均較對照病毒組NeuN陽性細(xì)胞數(shù)增多

        Fig 9 The virus group (Inhibiting miR-134) had more NeuN-positive cells than the control virus group

        A: Statistical representation for the NeuN-positive cells in DG; B: Statistical representation for the NeuN-positive cells in CA1; C: Statistical representation for the NeuN-positive cells in CA3.

        bP< 0.05,cP< 0.001,vsCont virus group.

        圖10 病毒組(Inhibiting miR-134)及對照病毒組海馬DG、CA1及CA3區(qū)Tunel染色

        Fig 10 Tunel staining in hippocampus (DG, CA1 and CA3) in virus group and cont virus group

        A: Tunel staining in DG of cont virus group; B: Tunel staining in CA1 of cont virus group; C: Tunel staining in CA3 of cont virus group; D: Tunel staining in DG of virus group; E: Tunel staining in CA1 of virus group; F: Tunel staining in CA3 of virus group.

        圖11 病毒組(Inhibiting miR-134)較對照病毒組海馬DG、 CA1及CA3區(qū)Tunel染色陽性細(xì)胞減少

        Fig 11 The virus group (inhibiting miR-134) had less Tunel-positive cells than the control virus group

        A: Statistical representation for the Tunel-positive cells in DG; B: Statistical representation for the Tunel -positive cells in CA1; C: Statistical representation for the Tunel-positive cells in CA3.

        cP<0.001,vsCont virus group.

        討 論

        SE指一次癲癇發(fā)作超過30 min或者兩次發(fā)作期間患者意識(shí)未恢復(fù)[7]。SE的發(fā)病率及死亡率很高,是威脅生命的神經(jīng)內(nèi)科急癥之一[8],快速有效治療癲癇持續(xù)狀態(tài)的方法是目前神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)。

        miRNA是一種高度保守的內(nèi)源性的長約19~24個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA,miRNA通過堿基互補(bǔ)配對原則特異性地與一個(gè)或多個(gè)靶基因的mRNA結(jié)合,導(dǎo)致mRNA降解或者翻譯抑制,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)多種蛋白的翻譯[9]。這些蛋白的功能涉及神經(jīng)元形態(tài)、離子通道及神經(jīng)元遷移等,越來越多證據(jù)表明表明microRNA在癲癇的發(fā)生機(jī)制中扮演了重要角色[10]。

        MiR-134是一種腦內(nèi)特異的miRNA,位于人類第14號染色體,表達(dá)于腦內(nèi)神經(jīng)元和樹突[11]。SE可引起miR-134在海馬表達(dá)增加,有研究表明在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的海馬和難治性癲癇患者的顳葉皮層中miR-134的表達(dá)水平增高[12]。為了探討miR-134抑制在大鼠匹羅卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中效果如何,我們首先制備抑制miR-134慢病毒,然后建立大鼠匹羅卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型,2 w后將抑制miR-134的慢病毒立體定向注射于大鼠海馬,發(fā)現(xiàn)同對照病毒組相比SE發(fā)作潛伏期縮短(P< 0.01),發(fā)作腦電總功率較對照病毒組降低(P< 0.001),癲癇持續(xù)狀態(tài)持續(xù)時(shí)間較對照病毒組縮短(P< 0.05),但發(fā)作劇烈程度無明顯差別(P> 0.05)。通過免疫組化染色顯示癲癇持續(xù)狀態(tài)3 d后病毒組(Inhibiting miR-134)CA1、CA3及齒狀回NeuN染色陽性細(xì)胞數(shù)較對照病毒組增加(P<0.001,P<0.05);而Tunel染色陽性細(xì)胞數(shù)叫對照病毒組減少(P<0.001),提示抑制miR-134表達(dá)可能有減少神經(jīng)元凋亡作用。

        綜上所述,慢病毒介導(dǎo)miR-134表達(dá)抑制后可以縮短成年匹羅卡品大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期,縮短SE發(fā)作時(shí)間,降低腦電功率,減少發(fā)作導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡。這些證據(jù)均為通過抑制miR-134治療癲癇持續(xù)狀態(tài)提供新的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù),為防治癲癇持續(xù)狀態(tài)帶來新希望。

        猜你喜歡
        海馬癲癇
        海馬
        癲癇中醫(yī)辨證存在的問題及對策
        海馬
        玩電腦游戲易引發(fā)癲癇嗎?
        “海馬”自述
        癲癇共患ADHD兒童的生態(tài)學(xué)執(zhí)行功能
        小海馬和海馬爸爸
        大灰狼(2015年6期)2015-07-16 21:01:00
        海馬
        左氧氟沙星致癲癇持續(xù)狀態(tài)1例
        中醫(yī)針?biāo)幹委熌X卒中后癲癇臨床觀察
        欧美国产综合欧美视频| 日本一区二区在线看看| 中文日本强暴人妻另类视频| 极品粉嫩嫩模大尺度无码视频| 男女爱爱好爽视频免费看| 色婷婷综合激情| 国产毛片一区二区三区| 中文字幕一区二区精品视频| 精品久久久久久无码人妻热| 轻点好疼好大好爽视频 | 欧美老妇人与禽交| 日本一本草久国产欧美日韩| 亚洲精品在线一区二区| 超碰97人人射妻| 久久亚洲av成人无码国产| 在线a人片免费观看高清| 久久一区二区av毛片国产| 久久精品中文闷骚内射| 国产成人精品无码播放| 欧美亚洲另类 丝袜综合网| 色av色婷婷18人妻久久久| 中文字幕人妻饥渴浪妇| 成人免费看片又大又黄| 亚洲中文字幕在线爆乳| 亚洲女同高清精品一区二区99| 人妻中文字幕在线网站| 人妻妺妺窝人体色www聚色窝| 亚洲欧美成人在线免费| 亚洲乱码一区二区av高潮偷拍的| 少妇人妻精品一区二区三区| 欧美成人小视频| 国产av一区仑乱久久精品| 亚洲成熟女人毛毛耸耸多| 亚洲精品中文字幕无码蜜桃| 午夜爽毛片| 国产女同舌吻1区2区| 欧洲熟妇色xxxx欧美老妇多毛| 欧美精品AⅤ在线视频| 国产三级韩三级日产三级| 亚洲精品蜜夜内射| 最近日韩激情中文字幕|