王小木 賈瑞華 姜瞾 王津存 夏峰*

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710032; 2解放軍457醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430012)

癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE)的年發(fā)病率為10/10萬～40/10萬，為神經(jīng)內(nèi)科中僅次于急性腦血管病的急危重癥。探索新的起效快、作用強(qiáng)的治療方法，成為神經(jīng)科臨床工作中亟待解決的難點(diǎn)問題。近年來研究發(fā)現(xiàn)微小核糖核酸(microRNAs, miRNAs)在癲癇的發(fā)生機(jī)制中扮演了重要角色[1-2]。其中微小核糖核酸-134(microRNA-134, miR-134)作為一種特異性的表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)的miRNA，主要參與神經(jīng)元微觀結(jié)構(gòu)的調(diào)控，如樹突棘的密度與長度等，進(jìn)而調(diào)控局部神經(jīng)回路的興奮性[3-5]。既往研究表明，在動(dòng)物癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)生過程中，海馬miR-134表達(dá)出現(xiàn)了明顯的上調(diào)[5]。結(jié)合其特異性的表達(dá)與生理功能，我們假設(shè)：miR-134可能參與了癲癇持續(xù)狀態(tài)的發(fā)生，對其深入研究可能為癲癇持續(xù)狀態(tài)的治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。本研究首先構(gòu)建大鼠miR-134抑制慢病毒載體，再應(yīng)用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射建立大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，觀察miR-134抑制對大鼠發(fā)作潛伏期，癲癇持續(xù)狀態(tài)時(shí)間，發(fā)作嚴(yán)重程度，腦電圖功率以及海馬神經(jīng)元凋亡的影響，以期闡明miR-134在癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)生中的作用。

材料與方法

一、構(gòu)建大鼠miR-134抑制慢病毒載體

構(gòu)建并驗(yàn)證大鼠miR-134抑制慢病毒載體[6]。

二、建立氯化鋰-匹羅卡品大鼠SE模型

觀察miR-134抑制對大鼠發(fā)作潛伏期，癲癇持續(xù)狀態(tài)時(shí)間，發(fā)作嚴(yán)重程度，腦電功率以及海馬神經(jīng)元凋亡的影響。

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：雄性(Spraque-Dawley, SD)大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組，病毒組及對照病毒組。

2.大鼠海馬立體定向注射及海馬腦電圖電極安裝：大鼠以10%的水合氯醛麻醉后固定于立體定位儀；以前囟作為參考點(diǎn)，前點(diǎn)：前囟后3.0 mm，偏右或偏左1.4 mm，深度3.0 mm；后點(diǎn)：前囟后4.0 mm，偏右或偏左4.4 mm，深度3.2 mm。在相應(yīng)部位打開顱骨，利用微量注射器將3 L慢病毒注入海馬。放置海馬電極：前囟后3.0 mm，偏右或偏左2.0 mm，深度2.6 mm。參考電極置于雙眼連線與矢狀縫相交處。

3.大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型的制備及腦電圖記錄：2 w后各組SD大鼠給予腹腔注射溴甲基東莨菪堿1 mg/kg；半小時(shí)后腹腔注射氯化鋰(130 mg/kg)，24 h后腹腔注射匹羅卡品50 mg/kg。發(fā)作劇烈程度按Racine分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，分級達(dá)Ⅳ級或以上者認(rèn)定為造模成功。大鼠出現(xiàn)SE后40 min給予地西泮5 mg/kg終止發(fā)作；記錄腦電圖并計(jì)算腦電總功率。

4.免疫組織化學(xué)：10%水合氯醛麻醉大鼠；經(jīng)左心室常規(guī)4%多聚甲醛灌注；取腦；腦組織置于4%多聚甲醛中固定8 h；置于40%蔗糖的磷酸緩沖溶液(phosphate buffer, PB)中，4 ℃存放，直至沉底。用冰凍切片機(jī)切成厚度為30 μm的薄片；進(jìn)行末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素脫氧尿嘧啶核苷酸缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated biotinylated deoxyuridine triphosphate, TUNEL)及神經(jīng)元核(neuronal Nuclei, NeuN)染色后。

5.實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測慢病毒立體定向注射2 w后各組大鼠海馬miR-134表達(dá)：各組大鼠總RNA提取后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以U6為內(nèi)參，進(jìn)行RT-PCR檢測。具體實(shí)驗(yàn)方法參照TaKaLa RR716試劑盒說明書。檢測所得數(shù)據(jù)通過2-△△CT法進(jìn)行相對定量。引物序列為：5'-GCGTACCAGAGGGAAAAAA-3'，5'-TGGGCCACCTAGTCACCAA-3'。

7.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程：如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物流程

Fig 1 Animal experiment process

結(jié) 果

一、各組大鼠腦電圖及發(fā)作潛伏期

1.比較匹羅卡品注射后各組大鼠癲癇Ⅴ級發(fā)作發(fā)作潛伏期：各組大鼠從腹腔注射匹羅卡品開始監(jiān)測行為學(xué)，記錄達(dá)到Ⅴ級發(fā)作的時(shí)間，生理鹽水組(100%, 5/5)，對照病毒組(100%, 7/7)，病毒組(72%, 8/11)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，病毒組潛伏期為(46.75±9.54)s，對照病毒組潛伏期(27.14±6.79)s，生理鹽水組潛伏期為(29.60±7.06)s，病毒組潛伏期比對照病毒組縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)，對照病毒組與生理鹽水組潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)(圖2)。

2.比較各組癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作時(shí)間，發(fā)作劇烈程度及腦電圖功率：病毒組(inhibiting miR-134)組、對照病毒組及生理鹽水組Racine評分無明顯差異(P> 0.05)(圖3)；同生理鹽水組和對照病毒組相比，病毒組(inhibiting miR-134)組癲癇持續(xù)狀態(tài)持續(xù)時(shí)間縮短(P< 0.05)，生理鹽水組和對照病毒組無明顯差異(P> 0.05)(圖4)；計(jì)算腦電總功率，同生理鹽水組和對照病毒組相比，病毒組(inhibiting miR-134)組腦電總功率降低(P< 0.001)(圖5)。

二、慢病毒立體定向注射后大鼠海馬miR-134的表達(dá)

帶有紅色熒光蛋白的慢病毒立體定向注射于大鼠海馬2 w后，灌注，制備為30 μm腦片，利用熒光顯微鏡觀察。在海馬CA1、CA2及CA3區(qū)有紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞表達(dá)(圖6)。

三、RT-PCR檢測慢病毒立體定向注射后各組大鼠海馬miR-134的表達(dá)

立體定向注射慢病毒2 w后，正常對照組與對照病毒組miR-134表達(dá)無明顯差異(P> 0.05)。相對于正常組及對照病毒組大鼠，miR-134抑制病毒組(inhibiting miR-134組)大鼠海馬miR-134表達(dá)降低(圖7) (P< 0.001)。

圖2 病毒組(Inhibiting miR-134)較生理鹽水組及對照病毒組Ⅴ級發(fā)作潛伏期延長

Fig 2 Compared to the control group and NS group, the virus group had longer racine score Ⅴ lantency

aP< 0.01,vsCont virus group and NS group.

圖3 病毒組(Inhibiting miR-134)和生理鹽水組及對照病毒組發(fā)作強(qiáng)度無明顯差異

Fig 3 No significant difference in seizure severity was showed among the control group, NS group and virus group.

圖4 病毒組(Inhibiting miR-134)同生理鹽水組及對照病毒組相比，癲癇持續(xù)狀態(tài)時(shí)間縮短

Fig 4 Compared to the control virus group, the virus group had shorter duration of SE

bP< 0.05,vsCont virus group and NS group.

圖5 病毒組(Inhibiting miR-134)同生理鹽水組及對照病毒組相比，腦電總功率降低

Fig 5 Compared to the control virus group, the virus group had lower total EEG power

cP<0.001,vsCont virus group and NS group.

圖6 大鼠海馬紅色熒光蛋白表達(dá)

Fig 6 The expression of red fluorescence protein in rat hippocampus at 2 w after virus injection

圖7 RT-PCR檢測立體定向注射2 w后正常對照組、對照病毒組和miR-134抑制病毒組大鼠海馬miR-134表達(dá)水平

Fig 7 Expression of miR-134 in virus group, contvirus group and normal cont group at 2 w after virus injection detected by RT-PCR

cP< 0.001,vsCont virus group.

四、NeuN染色及Tunel染色檢測癲癇持續(xù)狀態(tài)3 d后病毒組(inhibiting miR-134)和對照病毒組海馬損傷情況

1.NeuN染色顯示癲癇持續(xù)狀態(tài)后3 d，病毒組(inhibiting miR-134)齒狀回(dentate gyrus, DG)，CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元均較和對照病毒組增多(圖8～9)。

2.Tunel染色顯示癲癇持續(xù)狀態(tài)后3 d，病毒組(inhibiting miR-134)DG、CA1及CA3區(qū)凋亡細(xì)胞較對照病毒組減少(圖10)。

圖8 病毒組(Inhibiting miR-134)及對照病毒組海馬DG、CA1及CA3區(qū)NeuN染色

Fig 8 NeuN staining in hippocampus (DG, CA1 and CA3) in virus group and cont virus group

A: NeuN staining in hippocampus of cont virus group; B: NeuN staining in hippocampus of virus group; C: NeuN staining in DG of cont virus group; D: NeuN staining in DG of virus group; E: NeuN staining in CA1 of cont virus group; F: NeuN staining in CA1 of virus group; G: NeuN staining in CA3 of cont virus group; H: NeuN staining in CA3 of virus group.

圖9 病毒組(Inhibiting miR-134)海馬DG, CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元均較對照病毒組NeuN陽性細(xì)胞數(shù)增多

Fig 9 The virus group (Inhibiting miR-134) had more NeuN-positive cells than the control virus group

A: Statistical representation for the NeuN-positive cells in DG; B: Statistical representation for the NeuN-positive cells in CA1; C: Statistical representation for the NeuN-positive cells in CA3.

bP< 0.05,cP< 0.001,vsCont virus group.

圖10 病毒組(Inhibiting miR-134)及對照病毒組海馬DG、CA1及CA3區(qū)Tunel染色

Fig 10 Tunel staining in hippocampus (DG, CA1 and CA3) in virus group and cont virus group

A: Tunel staining in DG of cont virus group; B: Tunel staining in CA1 of cont virus group; C: Tunel staining in CA3 of cont virus group; D: Tunel staining in DG of virus group; E: Tunel staining in CA1 of virus group; F: Tunel staining in CA3 of virus group.

圖11 病毒組(Inhibiting miR-134)較對照病毒組海馬DG、 CA1及CA3區(qū)Tunel染色陽性細(xì)胞減少

Fig 11 The virus group (inhibiting miR-134) had less Tunel-positive cells than the control virus group

A: Statistical representation for the Tunel-positive cells in DG; B: Statistical representation for the Tunel -positive cells in CA1; C: Statistical representation for the Tunel-positive cells in CA3.

cP<0.001,vsCont virus group.

討 論

SE指一次癲癇發(fā)作超過30 min或者兩次發(fā)作期間患者意識(shí)未恢復(fù)[7]。SE的發(fā)病率及死亡率很高，是威脅生命的神經(jīng)內(nèi)科急癥之一[8]，快速有效治療癲癇持續(xù)狀態(tài)的方法是目前神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)。

miRNA是一種高度保守的內(nèi)源性的長約19～24個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，miRNA通過堿基互補(bǔ)配對原則特異性地與一個(gè)或多個(gè)靶基因的mRNA結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或者翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)多種蛋白的翻譯[9]。這些蛋白的功能涉及神經(jīng)元形態(tài)、離子通道及神經(jīng)元遷移等，越來越多證據(jù)表明表明microRNA在癲癇的發(fā)生機(jī)制中扮演了重要角色[10]。

MiR-134是一種腦內(nèi)特異的miRNA，位于人類第14號染色體，表達(dá)于腦內(nèi)神經(jīng)元和樹突[11]。SE可引起miR-134在海馬表達(dá)增加，有研究表明在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的海馬和難治性癲癇患者的顳葉皮層中miR-134的表達(dá)水平增高[12]。為了探討miR-134抑制在大鼠匹羅卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中效果如何，我們首先制備抑制miR-134慢病毒，然后建立大鼠匹羅卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，2 w后將抑制miR-134的慢病毒立體定向注射于大鼠海馬，發(fā)現(xiàn)同對照病毒組相比SE發(fā)作潛伏期縮短(P< 0.01)，發(fā)作腦電總功率較對照病毒組降低(P< 0.001)，癲癇持續(xù)狀態(tài)持續(xù)時(shí)間較對照病毒組縮短(P< 0.05)，但發(fā)作劇烈程度無明顯差別(P> 0.05)。通過免疫組化染色顯示癲癇持續(xù)狀態(tài)3 d后病毒組(Inhibiting miR-134)CA1、CA3及齒狀回NeuN染色陽性細(xì)胞數(shù)較對照病毒組增加(P<0.001，P<0.05)；而Tunel染色陽性細(xì)胞數(shù)叫對照病毒組減少(P<0.001)，提示抑制miR-134表達(dá)可能有減少神經(jīng)元凋亡作用。

綜上所述，慢病毒介導(dǎo)miR-134表達(dá)抑制后可以縮短成年匹羅卡品大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期，縮短SE發(fā)作時(shí)間，降低腦電功率，減少發(fā)作導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡。這些證據(jù)均為通過抑制miR-134治療癲癇持續(xù)狀態(tài)提供新的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)，為防治癲癇持續(xù)狀態(tài)帶來新希望。