李安榮 王靜 王輝 張濤 周平 朱瑞娟

(湖北省十堰市太和醫(yī)院/湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院: 1神經(jīng)外科; 2病理科，湖北 十堰 442000)

腦膠質(zhì)瘤是臨床最常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，傳統(tǒng)的腦膠質(zhì)瘤治療包括外科手術(shù)治療、聯(lián)合放療和化療的干預(yù)等，在治療過(guò)程中，盡管積極采取聯(lián)合治療方案，但預(yù)后仍然相當(dāng)差。腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展涉及到許多癌基因的擴(kuò)增、抑癌基因的失活以及一些重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常，這些分子水平的改變直接影響到了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等一系列生物學(xué)行為[1]，因此，基因治療作為腦膠質(zhì)瘤治療的一種新的分子工具，對(duì)于提高臨床療效具有是十分重要的意義，本文利用RNAi技術(shù)，在體外抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞PDGF-B基因的表達(dá),探討膠質(zhì)瘤RNAi治療的新靶點(diǎn)。

材料與方法

一、材料及腫瘤細(xì)胞株

小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)雙鏈由上海吉馬生物技術(shù)工程公司合成，序列如下：正義鏈5'-CCACTCGATCCGCTCCTTTGA-3'；反義鏈5'-UUAGCCTGTTGAGAACCTGGC-3'；Trizol試劑(Invitrogen公司)； PCR引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；DNA 回收純化試劑盒購(gòu)自Fermentas公司、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)購(gòu)自Sigma 公司；瓊脂粉購(gòu)自日本Agar公司；1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)；特級(jí)胎牛血清(杭州四季青公司)；T4 DNA Ligase(Fermentas公司)；鼠抗人PDGF-B單克隆抗體，羊抗鼠二抗IgG(美國(guó)Santa Cruz公司)；瓊脂糖(Invitrogen公司)；硝酸纖維素膜(購(gòu)自晶美公司)；二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)(Sigma公司)；細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(美國(guó)AXYGEN公司)。人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株來(lái)自武漢大學(xué)科研中心保存，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)和傳代。實(shí)驗(yàn)分組：第1組為實(shí)驗(yàn)組，即轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞組，第2組為陰性對(duì)照組，即轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的細(xì)胞組；第3組為細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)不予以干預(yù)組。

二、轉(zhuǎn)染后PDGF-B的表達(dá)

1.實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測(cè)血小板源生長(zhǎng)因子-B(platelet derived growth factor subunit B, PDGF-B)mRNA的表達(dá)水平 PDGF-B引物：上游5'-CATGCGTGTGAGACAGTGGT-3'，下游5'-GACGGA CGAGG CACAATA-3'，內(nèi)參基因β actin引物：上游5'-CATGCGTGTGAGACAGTGGT-3',下游5'-GACGGACGAGG CACAATA-3'，25 μL標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系, 反應(yīng)條件為：94 ℃解鏈30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸60 s，共35循環(huán)。PCR產(chǎn)物上 2% 瓊脂糖凝膠電泳20 min，紫外光下照相，以目的基因、內(nèi)參的灰度比值做相對(duì)定量分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.Western blot法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞株P(guān)DGF-B蛋白表達(dá)：提取待測(cè)細(xì)胞蛋白進(jìn)行定量，將樣品調(diào)成相同濃度，加入十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)凝膠加樣緩沖液，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，將膜置于封閉液中于4 ℃封閉過(guò)夜以除去非特異的結(jié)合位點(diǎn)，然后一抗孵育，用含1×TBS，洗膜3次，再與二抗孵育，同上洗膜3次。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gelelectrophoresis, PAGE)分離蛋白條帶，電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，顯色，用圖像分析系統(tǒng)對(duì)每組圖像結(jié)果進(jìn)行分析，以蛋白條帶的灰度掃描比值來(lái)表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平及統(tǒng)計(jì)分析。

三、轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和凋亡的影響

1.MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性：采用四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色法，待測(cè)細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，將細(xì)胞的密度調(diào)整為2×104個(gè)/mL，96孔板每孔接入100 μL細(xì)胞懸液，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。同時(shí)設(shè)空白組，即孔內(nèi)加入100 μL 改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM)，不含細(xì)胞；按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排，分別加入不同濃度的藥物量，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；分別在轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h于570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光值，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A 值)×100%。

2.細(xì)胞周期檢測(cè)：轉(zhuǎn)染48 h后將3組細(xì)胞消化、離心, 收集細(xì)胞 (1×106個(gè)), 用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)洗滌2次，用70%乙醇固定細(xì)胞，置4 ℃過(guò)夜，離心棄乙醇，PBS洗滌2次，PBS懸浮細(xì)胞加入碘化丙錠染色液，室溫下作用15 min，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

結(jié) 果

一、RT-PCR檢測(cè)PDGF-B基因mRNA表達(dá)情況

通過(guò)PT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在siRN轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組(negative control, NC)和空白對(duì)照組(U251)均有PDGF-B基因mRNA的表達(dá)，經(jīng)過(guò)siRNA干預(yù)沉默PDGF-B基因以后，轉(zhuǎn)染組U251細(xì)胞中PDGF-B的mRNA表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組和空白組(見(jiàn)圖1)，siRNA組PDGF相對(duì)表達(dá)量是0.54±0.03，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.11,P<0.05)。

二、Western blot檢測(cè)U251細(xì)胞經(jīng)RNA干擾后PDGF-B的蛋白表達(dá)情況

各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，Western blot檢測(cè)U251細(xì)胞經(jīng)RNA干擾后PDGF-B的蛋白表達(dá)情況，采用Quantity One 軟件分析目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值來(lái)表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量，得到siRNA組PDGF相對(duì)蛋白表達(dá)量是0.12±0.04，相比U251組、NC組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.43,P<0.01，圖2)。

三、MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的變化情況

在轉(zhuǎn)染后的1～7 d分別利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，并繪制細(xì)胞增殖曲線圖，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖較空白組明顯緩慢(見(jiàn)圖3)。

四、流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期變化

采用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組即轉(zhuǎn)染PDGF-B siRNA組G0～G1期細(xì)胞21.54%，S期細(xì)胞60.28%，G2～M期細(xì)胞18.18%；陰性對(duì)照組(NC組)G0～G1期細(xì)胞66.94%，S期細(xì)胞21.07%，G2～M期細(xì)胞11.98%；空白對(duì)照組(U251組)G0～G1期細(xì)胞61.28%，S期細(xì)胞28.44%，G2～M期細(xì)胞10.28%；分析表明干擾組細(xì)胞大多停留在S期，U251細(xì)胞的有絲分裂明顯受到抑制(見(jiàn)圖4)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示在轉(zhuǎn)染PDGF-B siRNA組中，在G1期前還出現(xiàn)比較高比例的亞二倍體細(xì)胞(見(jiàn)圖5)，提示RNA干擾組中U251細(xì)胞凋亡明顯增多。

圖1 RT-PCR檢測(cè)PDGF-B基因的mRNA表達(dá)量

Fig 1 Relative expression of PDGF-B gene detected by fluorescence real-time quantification PCR

aP<0.05,vsNC group;bP>0.05,vsU251 group.

圖2 U251細(xì)胞經(jīng)RNA干擾后PDGFB蛋白表達(dá)明顯下調(diào)

Fig 2 Western blot showed that PDGF-B protein expression of U251 cells was significantly inhibited in siRNA transfected group

圖3 細(xì)胞增殖曲線顯示RNA干擾組增殖較空白組明顯緩慢

Fig 3 MTT assay showed that the proliferation of U251 cells in siRNA transfection group was significantly lower than that in the control group

圖4 細(xì)胞周期分析結(jié)果

Fig 4 Result of cell cycle analysis

A: In siRNA group, G0/G1-phase cell fraction was 21.54%, S-phase cell fraction was 60.28%，and G2/M-phase cell fraction was 18.18%; B: In NC group, G0/G1-phase cell fraction was 66.94%, S-phase cell fraction was 21.07%，and G2/M-phase cell fraction was 11.98%; C: In U251 group, G0/G1-phase cell fraction was 61.28%, S-phase cell fraction was 28.44%，and G2/M-phase cell fraction was 10.28%.

圖5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

Fig 5 Apoptosis assay

A: NC group; B～F: In siRNA group, the results showed a typical sub-diploid peak before G0/G1phase.

討 論

腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展涉及到許多癌基因的擴(kuò)增、抑癌基因的失活以及一些重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常，這些分子水平的改變直接影響到了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等一系列生物學(xué)行為[2]。目前普遍認(rèn)為，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的關(guān)鍵在于如何能有效抑制術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)，隨著新的腫瘤治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，利用新的抗腫瘤手段結(jié)合新的靶向治療，成為膠質(zhì)瘤治療的一大熱點(diǎn)。血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF)屬于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族，是由A、B、C、D 4條多肽鏈通過(guò)二硫鍵形成的同源性或異源性二聚體分子，共有PDGF-AA、BB、AB、CC、DD 5種亞型[3]。其受體有兩種，α受體(含1 066個(gè)氨基酸殘基)和β受體(含l 074個(gè)氨基酸殘基)，均屬酪氨酸激酶受體家族成員，都是跨膜的糖蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，PDGF和PDGFR在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株和手術(shù)標(biāo)本中都有過(guò)表達(dá)，并且與隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的增加而表達(dá)增高，預(yù)后越差[4]，提示在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，PDGF家族可能起著重要作用。

c-sis(v-sis)是從猿肉瘤病毒中分離出來(lái)的原癌基因，該原癌基因編碼PDGF-B鏈，PDGF-B鏈基因也含有7個(gè)外顯子，B鏈基因位于人的22號(hào)染色體長(zhǎng)臂12區(qū)2段和13區(qū)1段上[5]。由此可見(jiàn)，PDGF不僅作為生長(zhǎng)因子在膠質(zhì)瘤的增殖、侵襲過(guò)程中發(fā)揮作用，其PDGF-B鏈作為原癌基因的產(chǎn)物，對(duì)腫瘤的發(fā)展可能也有生物學(xué)效應(yīng)[6]。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)，PDGF的自主分泌途徑造成PDGF的過(guò)度表達(dá)可能是誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、惡變和膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的重要因素，并且PDGF家族在腫瘤的血管生成及微循環(huán)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用[7]。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默的強(qiáng)大工具，RNAi成為一種高效、特異性的分子水平的研究工具，不僅對(duì)細(xì)胞的分化和發(fā)育起著舉足輕重的作用，而且對(duì)研究基因功能潛在的靶向治療具有巨大的應(yīng)用潛力。至今已有超過(guò)300個(gè)通過(guò)RNA干擾靶向膠質(zhì)瘤治療的報(bào)道，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中運(yùn)用RNA干擾技術(shù)使雙鏈RNA失配，并引起抗增殖效果[8]，無(wú)論是在體內(nèi)還是體外，RNAi技術(shù)已被用來(lái)研究針對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞增殖及浸潤(rùn)、血管生成等多個(gè)方面[9]。

本實(shí)驗(yàn)利用RNA干擾技術(shù)，針對(duì)PDGF-B靶基因設(shè)計(jì)干擾鏈，通過(guò)將干擾鏈轉(zhuǎn)染入人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株，來(lái)觀察沉默PDGF-B鏈后，對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA的U251細(xì)胞株比對(duì)照組細(xì)胞的增殖降低，凋亡明顯增多。由此可見(jiàn)，PDGF-B基因在膠質(zhì)瘤的增殖、侵襲、惡性變的過(guò)程中可能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[10]，阻斷或者降低PDGF-B在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，有望降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。但由于膠質(zhì)瘤的增殖、分化和侵襲與多種生長(zhǎng)因子及其受體、原癌基因激活和抑癌基因的失活等有關(guān)，是一個(gè)多信號(hào)、多因素調(diào)節(jié)的過(guò)程，單一抑制PDGF-B對(duì)下游信號(hào)傳導(dǎo)的影響力有待于進(jìn)一步研究和探討。