尚 柯，楊方威，李 俠*，張春暉，錢書意，孫 圳

中國是世界肉類產(chǎn)銷總量最多的國家，據(jù)國際肉類組織公布數(shù)據(jù)顯示，中國畜禽肉類生產(chǎn)總量約占世界的27%[1]。凍藏作為肉類最重要的貯藏方式，能有效抑制微生物生長繁殖、延長貨架期，是肉類產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易和地區(qū)間流通的主要產(chǎn)品形態(tài)。然而，肉品在經(jīng)冷凍、凍藏、解凍后汁液流失與品質(zhì)劣變十分嚴(yán)重[2-4]。肉品的保水性是衡量肉品品質(zhì)重要的指標(biāo)之一，直接影響肉品的感官品質(zhì)與食用品質(zhì)[5]。我國冷凍肉解凍后汁液損失嚴(yán)重，給生產(chǎn)企業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。因此，探究提高肉品保水性的新型凍結(jié)解凍技術(shù)具有極其重要的意義。

目前，肉類凍結(jié)解凍技術(shù)主要有超高壓凍結(jié)解凍、電場凍結(jié)解凍、超聲波凍結(jié)解凍、磁場凍結(jié)、微波解凍和靜電場輔助凍結(jié)-解凍技術(shù)等[7]，其中靜電場輔助凍結(jié)-解凍技術(shù)具有效率高、設(shè)備成本低、操作簡單等優(yōu)勢[8]。該技術(shù)有助于提高冷凍食品的解凍速率、降低汁液流失、使解凍后肉品溫度均勻、減少食品油脂酸化、抑制微生物生長、提高食品品質(zhì)。靜電場技術(shù)最早被用于水果和蔬菜的保鮮[9-12]，Bajgai等[13]運(yùn)用高壓靜電場技術(shù)延長了水果保質(zhì)期。Hsieh[14]、郭衍銀[15]等在胡蘿卜汁與冬棗的研究中得出相似結(jié)論，經(jīng)高壓靜電場處理后蔬果的保質(zhì)期長，新鮮度和營養(yǎng)價值得到提高。Zhao Ruiping等[16]認(rèn)為靜電場輔助處理可以提高青西紅柿的抗氧化能力。也有學(xué)者先后在肉制品和水產(chǎn)品品質(zhì)控制方面進(jìn)行了研究。Hsieh等[17]發(fā)現(xiàn)，冷凍雞胸肉在高壓靜電場作用下，其解凍時間較對照組縮短，多種微生物指標(biāo)低于對照組。孫芳等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)解凍相比，高壓靜電場技術(shù)可縮短凍結(jié)牛肉解凍時間，顯著降低解凍汁液流失。He Xiangli等[8]認(rèn)為高壓靜電場對肉品嫩度及相關(guān)食用品質(zhì)產(chǎn)生有益效果。Mousakhani-Ganjeh等[9]研究表明，靜電場能顯著提高冷凍魚塊解凍速率和揮發(fā)性鹽基氮。但高壓靜電場的輸出電壓通常高于3 000 V，存在一定的安全隱患，具有一定局限性，不能運(yùn)用于大規(guī)模食品凍結(jié)與解凍[19-20]。

低壓靜電場（low voltage electrostatic field，LVEF）可產(chǎn)生2 500 V左右的空間電勢，影響食品內(nèi)部細(xì)胞的生命活力、凍結(jié)及解凍速率，不僅較高壓靜電場作用安全、節(jié)能，并且能達(dá)到食品保鮮、延長食品貨架期的目的，已引起廣泛關(guān)注[21]。Uemura等[22]的研究發(fā)現(xiàn)LVEF可顯著減少豬肉的解凍時間。路立立[23]的研究中，同樣認(rèn)為通過靜電場處理可提高豬肉凍結(jié)、解凍速率及解凍后嫩度。但是目前學(xué)者的研究主要集中在肉品品質(zhì)變化方面，關(guān)于靜電場輔助凍結(jié)-解凍對于肉品蛋白質(zhì)中水分遷移規(guī)律未知，對蛋白質(zhì)理化特性的研究較少。為探究基于靜電場輔助凍結(jié)-解凍條件下肌肉水分分布規(guī)律，揭示蛋白質(zhì)理化特性的變化，本實(shí)驗(yàn)研究2 500 V LVEF環(huán)境下對牛肉保水性及蛋白理化特性的影響，為冷凍肉品質(zhì)控制技術(shù)開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料肉由北京御香苑畜牧有限公司提供，檢疫合格、質(zhì)量約為400 kg的2 歲齡草原黃牛背最長?。˙oine Longissmus dorsi）。牛屠宰后經(jīng)48 h吊掛風(fēng)冷排酸，從6 頭情況相近的公牛胴體中分別取2 塊背最長肌，共12 塊肉樣，每塊約為5 cm×4 cm×4 cm，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后4 ℃冷藏并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)所用常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；735型溫度儀 德國德圖儀器有限公司；BCDW-228冰箱、DW-86L386型立式超低溫保存箱 青島海爾股份有限公司；Kjeltec 2300微量凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司；Q200差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國TA公司；Allegra X-12R冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter有限公司；T6紫外分光光度計(jì) 北京普析通用有限公司；MesoMR23-060H-I低場核磁共振（low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）分析及成像系統(tǒng) 上海紐邁電子科技有限公司；DENBA＋鮮度保持電場裝置 日本AGUA商事株式會社。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

本實(shí)驗(yàn)所采用的LVEF裝置由靜電場發(fā)生裝置和放電板組成，放電板在冷藏庫內(nèi)產(chǎn)生LVEF，形成負(fù)離子環(huán)境，物料不與放電板直接接觸，輸出電壓2 500 V、電流0.2 mA，即為LVEF。其原理是離子化的氣體在電場內(nèi)移動，從而使帶電粒子再受電場作用，從一極向另一極進(jìn)行定向移動，達(dá)到加工所需目的。

12 塊肉樣隨機(jī)平均分為4 組，分別為自然凍結(jié)-解凍（conventional freezing-conventional thawing，C-C）組（對照組）、LVEF輔助凍結(jié)-解凍（LVEF freezing-LVEF thawing，L-L）組、自然凍結(jié)-LVEF輔助解凍（conventional freezing-LVEF thawing，C-L）組、LVEF輔助凍結(jié)-自然解凍（LVEF freezing-conventional thawing，L-C）組。用透明聚乙烯膜包裝后在-18 ℃冰柜中進(jìn)行凍結(jié)-解凍實(shí)驗(yàn)，肉樣距離靜電板均為30 cm。

將溫度儀探頭插入樣品幾何中心記錄其中心溫度，每隔5 min記錄一次溫度。當(dāng)肉樣中心溫度低至所設(shè)凍結(jié)溫度-18 ℃時，取出肉樣放置于4 ℃冰箱中進(jìn)行解凍實(shí)驗(yàn)，至中心溫度為1 ℃時視為解凍完全。

1.3.2 指標(biāo)測定

1.3.2.1 凍結(jié)-解凍曲線繪制

樣品凍結(jié)解凍過程中，將溫度儀插入樣品幾何中心記錄其中心溫度，每隔5 min記錄一次溫度，繪制凍結(jié)-解凍曲線[24]。凍結(jié)、解凍速率v按照式（1）、（2）國際制冷協(xié)會提出的計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算[25]。

式中：v1為凍結(jié)速率/（cm/h）；δ1為凍結(jié)過程中樣品表面到熱中心最短距離/cm；t1為樣品表面達(dá)0 ℃至熱中心溫度達(dá)初始凍結(jié)點(diǎn)以下10 ℃所需的時間/h；v2為解凍速率/（cm/h）；δ2為解凍過程中樣品表面與熱中心的最短距離/cm；t2為樣品表面達(dá)0 ℃至熱中心溫度達(dá)2 ℃所需的時間/h。

1.3.2.2 解凍汁液流失率測定

參照Honikel[26]的方法，準(zhǔn)確稱量解凍前、后肉塊的質(zhì)量，分別記為m1、m2，按照式（3）計(jì)算解凍汁液流失率。

1.3.2.3 肌原纖維蛋白表面疏水性測定

參照李銀等[27]的方法，從牛肉樣品中分離提取肌原纖維蛋白，再根據(jù)Chelh等[28]的方法，將肌原纖維蛋白懸浮液用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）調(diào)成2 mg/mL的溶液，取2 mL蛋白稀釋液并加入40 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液，充分混合?？瞻捉M為2 mL磷酸鹽緩沖液中直接加入40 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液。將4 組樣品置于室溫條件下振蕩10 min，然后在4 ℃條件下4 000×g離心15 min。上清液在595 nm波長處測定吸光度。按照式（4）計(jì)算結(jié)合態(tài)溴酚藍(lán)質(zhì)量，作為表面疏水性指數(shù)。

式中：A1為空白組吸光度；A2為樣品吸光度。

1.3.2.4 熱穩(wěn)定性分析

參考Deng等[29]的方法。準(zhǔn)確稱取肉樣10～16 mg，立即密封于鋁盒中，放入DSC儀中測定，并以空鋁盒為空白對照，測定條件為：樣品于20 ℃平衡2 min，再以3 ℃/min的速率升到100 ℃；每個樣品平行測定3 次，結(jié)果取3 次平均值。再參照李俠等[24]的計(jì)算方法將所得蛋白質(zhì)DSC熱流圖換算為蛋白質(zhì)變性溫度和變性焓。

1.3.2.5 水分遷移程度分析

參照謝小雷等[30]的方法，采用磁共振成像技術(shù)（magnetic resonance imaging，MRI）測定牛肉H質(zhì)子密度圖像，使用MesoMR23-060H-I LF-NMR分析及成像系統(tǒng)，將實(shí)驗(yàn)樣品放入永磁場中心位置的射頻線圈中心，進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)。主要參數(shù)為：重復(fù)時間2 000 ms，重復(fù)次數(shù)4 次，縱向弛豫時間20 ms；根據(jù)CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈沖序列測得的弛豫時間T2，選擇自旋回波時間20 ms。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)中采用Microsoft Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)并繪制分析圖，除特殊說明外，指標(biāo)測定均為3 次平行測定結(jié)果，表示為利用IBM SPSS Statistics 19統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行Duncan法多重比較及顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LVEF對凍結(jié)-解凍速率的影響

圖1 牛肉凍結(jié)-解凍過程中心溫度變化Fig. 1 Changes in internal temperature of beef during freezing and thawing process

圖1分別為4 個處理組肉樣的凍結(jié)和解凍曲線。凍結(jié)過程的溫度曲線趨勢大體相同，分為明顯下降、平緩下降、明顯下降3 個階段。凍結(jié)過程中，樣品內(nèi)部80%以上水分都凍結(jié)成冰，釋放相變熱，溫度下降緩慢，曲線平緩，該冰晶帶的起始溫度點(diǎn)即為凍結(jié)點(diǎn)。自然凍結(jié)與LVEF輔助凍結(jié)樣品通過最大冰晶生成帶歷時分別為6.08 h和2.67 h，LVEF輔助凍結(jié)較自然凍結(jié)歷時縮短了3.41 h。

表1 不同處理?xiàng)l件牛肉凍結(jié)-解凍速率和凍結(jié)-解凍時間變化Table 1 Changes in freezing-thawing rate and freezing-thawing time of beef subjected to different treatments

如表1所示，C-C組所需凍結(jié)時間為26.210 h，L-L、C-L、L-C組所需凍結(jié)時間分別為9.920、25.420 h和10.000 h。C-C組所需解凍時間為22.710 h，L-L、C-L、L-C組所需解凍時間分別為13.790、18.960 h和15.330 h。L-L組肉樣凍結(jié)時間較對照組縮短16.290 h，解凍時間較對照組縮短8.920 h，可見LVEF處理的樣品所需凍結(jié)-解凍時間較對照組明顯縮短，可以有效提高牛肉凍結(jié)-解凍速率。

2.2 LVEF對解凍汁液流失的影響

圖2 不同處理?xiàng)l件牛肉解凍汁液流失率（A）及蛋白質(zhì)含量（B）Fig. 2 Drip loss (A) during thawing and protein content (B) in beef subjected to different treatments

冷凍肉在解凍過程中汁液流失嚴(yán)重，流失的汁液中含有可溶性蛋白質(zhì)，使肉品的營養(yǎng)損失。由圖2A可知，4 組肉樣解凍汁液流失率分別為8.30%、4.19%、4.28%和6.58%。由圖2B可知，4 組肉樣流失汁液中蛋白質(zhì)含量分別為10.61%、9.91%、8.95%和10.10%。C-C組肉樣解凍汁液流失率、流失汁液中蛋白質(zhì)含量顯著高于其他3 組（P＜0.05），L-L組肉樣解凍汁液流失最少。結(jié)合圖1可知，LVEF處理可使肉樣凍結(jié)過程中通過最大冰晶生成帶所用時間短，凍結(jié)與解凍速率快，有利于降低解凍過程中肉樣汁液流失，從而保持牛肉的營養(yǎng)和風(fēng)味[31]。

2.3 LVEF對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)表面疏水性是表征與外界極性水環(huán)境相連的蛋白質(zhì)表面疏水性基團(tuán)數(shù)量的一個重要標(biāo)志，其值越大則蛋白持水性越小，也預(yù)示著蛋白質(zhì)的保水能力越弱，結(jié)合水和不易流動水越容易“態(tài)變”為自由水，解凍后汁液流失率也就越高。

圖3 不同處理?xiàng)l件牛肉蛋白質(zhì)表面疏水性變化Fig. 3 Effect of different treatments on surface hydrophobicity of beef proteins

圖3分別為4 個處理組肉樣凍結(jié)-解凍過程蛋白質(zhì)表面疏水性變化情況。C-C組與L-L、C-L、L-C組的肉樣在凍結(jié)過程中肌原纖維蛋白吸附結(jié)合態(tài)溴酚藍(lán)的質(zhì)量分別為27.57、16.16、27.57 μg和16.16 μg。在解凍過程中肌原纖維蛋白吸附結(jié)合態(tài)溴酚藍(lán)的質(zhì)量分別為13.14、9.45、4.37 μg和3.47 μg，各組間差異顯著（P＜0.05）。蛋白質(zhì)表面疏水性升高可能是蛋白質(zhì)分子解折疊，使肽鏈斷裂或結(jié)構(gòu)伸展，分子的內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)自然凍結(jié)-解凍處理的牛肉樣品中蛋白質(zhì)表面疏水性最低，表明LVEF凍結(jié)或解凍處理均能有效抑制疏水基團(tuán)的暴露，結(jié)合圖2可知，LVEF處理能夠延緩牛肉中蛋白在解凍過程中水合能力的下降，降低解凍汁液流失。

2.4 LVEF對蛋白熱穩(wěn)定性的影響

借助DSC記錄熱流量隨時間或溫度變化形成的曲線。就蛋白質(zhì)體系而言，當(dāng)提高到某個特定溫度時，蛋白質(zhì)本身受熱發(fā)生轉(zhuǎn)變，使蛋白質(zhì)發(fā)生熱解旋或凝聚，蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與周圍溶劑之間的相互作用導(dǎo)致熱量差的產(chǎn)生，在DSC曲線上形成“波峰”或“波谷”，其對應(yīng)的橫坐標(biāo)表示熱轉(zhuǎn)變發(fā)生的溫度[32]，從而體現(xiàn)蛋白質(zhì)的變性程度。

表2 不同處理?xiàng)l件牛肉蛋白質(zhì)DSC分析結(jié)果Table 2 DSC analysis of proteins in beef subjected to different treatments

研究表明，一個典型的肌肉DSC圖譜有3 個熱轉(zhuǎn)變區(qū)域；發(fā)生在54～58 ℃之間第1個熱吸收峰是由于主要由肌球蛋白受熱轉(zhuǎn)變而引起的，發(fā)生在65～67 ℃之間的熱吸收峰由膠原質(zhì)和肌漿蛋白變性引起，出現(xiàn)在80～83 ℃之間的峰是由肌動蛋白變性所引起的[33-34]。因此，峰1～3分別代表肌球蛋白、肌漿蛋白和肌動蛋白熱穩(wěn)定性的變化情況。峰的頂點(diǎn)溫度為蛋白變性溫度，3 個區(qū)域的峰面積代表蛋白質(zhì)的變性焓。本實(shí)驗(yàn)測定的3 個峰的溫度范圍分別為40～56、60～64、77～80 ℃。變性溫度反映了蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，變性溫度越高，其穩(wěn)定性越高。變性焓反映了蛋白質(zhì)變性的大小，其值越大，說明變性越小，抗變性能力越強(qiáng)[24]。

由表2可得，C-C組峰1、峰2熱變性溫度和變性焓顯著低于其他處理組（P＜0.05），L-L組峰1的熱變性溫度、變性焓顯著高于其他處理組（P＜0.05），各處理組峰3的熱變性溫度、變性焓之間無顯著性差異（P＞0.05）。這表明LVEF處理使肉樣肌球蛋白、肌漿蛋白的穩(wěn)定性較高，有助于維持肉樣該蛋白的抗變性能力，且該蛋白的變性程度小于LVEF輔助凍結(jié)作用或LVEF輔助解凍作用（L-C組和C-L組）。

2.5 LVEF對水分遷移程度的影響

LF-NMR技術(shù)是通過測定質(zhì)子在磁場中的弛豫特性來研究樣品中含水率、水分分布、遷移及其他相關(guān)品質(zhì)，主要包括MRI和磁共振波譜分析（magnetic resonance spectroscopy，MRS）技術(shù)。通過LF-NMR技術(shù)測定H質(zhì)子的橫向弛豫時間T2來表征肌肉中水分的變化規(guī)律[35]。H質(zhì)子的弛豫時間與水分的流動性密切相關(guān)，在食品體系中，水分狀態(tài)的不同，都會使弛豫時間T2發(fā)生改變[36]。肌肉中不同活動狀態(tài)的水，包括結(jié)合水、不易流動水和自由水，分別用T21、T22、T23所對應(yīng)的峰面積來表示各自的相對含量[37]。

表3 不同處理?xiàng)l件牛肉水分分布及組成Table 3 Moisture distribution and composition of beef subjected to different treatments

由表3可知，凍結(jié)過程C-C組不易流動水T22、自由水T23在NMR圖譜上信號較弱，相對含量較低，結(jié)合水T21相對含量達(dá)到97.100 0%，L-L組不易流動水T22未檢出，結(jié)合水T21相對含量大于對照組，自由水T23相對含量反之。解凍后，由于蛋白質(zhì)復(fù)性及表面疏水性的降低，發(fā)生水分回吸現(xiàn)象，部分自由水態(tài)變?yōu)椴灰琢鲃铀?。對照組解凍后的牛肉中較易轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤?，形成解凍損失，而L-L組肉樣中不易流動水相對比例較高，自由水相對含量為0.120 00%（P＜0.05）。推測認(rèn)為，LVEF處理影響了牛肉中不同活動狀態(tài)水的分布情況，使解凍后自由水含量顯著降低，從而解凍汁液損失降低。

利用MRI技術(shù)可以獲得肌肉中水、脂肪等成分的高分辨率H質(zhì)子密度像，能直觀地表現(xiàn)出肌肉中水分的分布及遷移[38-39]。MRI偽彩圖像中亮度越強(qiáng)，表明H質(zhì)子信號越強(qiáng)，該部分的含水率越高。

圖4 不同處理?xiàng)l件牛肉凍結(jié)-解凍過程H質(zhì)子密度加權(quán)偽彩圖Fig. 4 Weighted pseudo color images of H proton density in beef during different freezing-thawing processes

如圖4所示，在凍結(jié)過程中，自然凍結(jié)肉樣H質(zhì)子密度圖像顯示出零星的“亮點(diǎn)”，而LVEF輔助凍結(jié)處理的肉樣H質(zhì)子密度圖像中的“亮點(diǎn)”幾乎檢測不到；解凍后，L-L組肉樣較多地呈現(xiàn)出紅褐色，說明該處理組含水率豐富，C-C、C-L、L-C組解凍后肉樣較多地呈現(xiàn)出藍(lán)色，紅褐色較少，說明該處理組汁液流失較嚴(yán)重。LVEF輔助凍結(jié)-解凍能有效降低汁液流失率。

3 結(jié) 論

LVEF輔助凍結(jié)-解凍處理能夠顯著縮短肉樣通過最大冰晶生成帶的時間和解凍時間，有效提高牛肉凍結(jié)-解凍速率，有助于維持肌原纖維蛋白的抗變性能力和熱穩(wěn)定性，提高解凍過程中蛋白水合能力，降低肌肉中的自由水含量，從而有效地減少牛肉解凍汁液流失率，提高肌肉保水性。

LVEF輔助凍結(jié)-解凍處理可提高肉與肉制品品質(zhì)，LVEF不僅比高壓靜電場更安全、節(jié)能，并且同樣能達(dá)到食品保鮮、延長貨架期的目的。但LVEF對食品在凍結(jié)及解凍過程中的影響機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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