林松洋，郝利民*，劉 鑫，魯來(lái)政，康巧珍，魯吉珂,*

乳酸菌是一類能夠發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的總稱。乳酸菌的發(fā)酵作用可以改善產(chǎn)品風(fēng)味，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期等。因此乳酸菌作為一種重要的工業(yè)微生物，廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵行業(yè)[1]。由于高濃度的鹽能夠抑制一些導(dǎo)致食品腐敗的微生物和一些病原微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)根據(jù)產(chǎn)品加工工藝要求，在醬油、熏肉、泡菜等發(fā)酵食品制備過(guò)程中通常會(huì)加入大量的食用鹽，既滿足了產(chǎn)品的風(fēng)味要求，又可以延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期。但高濃度鹽是乳酸菌發(fā)酵過(guò)程的不利因素，其會(huì)改變細(xì)胞外界滲透壓，引起菌體細(xì)胞體積縮小，導(dǎo)致胞內(nèi)各種生理代謝活動(dòng)紊亂甚至死亡。因此乳酸菌在高鹽環(huán)境下的生存能力對(duì)發(fā)酵食品的品質(zhì)起著關(guān)鍵作用。為了開(kāi)發(fā)耐鹽乳酸菌，或?qū)ふ液线m的鹽脅迫保護(hù)物質(zhì)，需要更深入地了解乳酸菌的耐鹽機(jī)制。本文對(duì)鹽脅迫下乳酸菌調(diào)節(jié)胞內(nèi)滲透壓的機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)闡釋，旨在尋找與乳酸菌鹽脅迫適應(yīng)相關(guān)的代謝通路以及相應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用的保護(hù)物質(zhì)，以期為采用基因工程、發(fā)酵工程和酶工程等手段提高鹽脅迫環(huán)境乳酸菌的存活率提供理論依據(jù)，進(jìn)而為更有效地利用乳酸菌提供參考[2]。

1 國(guó)內(nèi)外乳酸菌耐鹽文獻(xiàn)總結(jié)

在Web of Science分別以Lactobacillus salt tolerance（乳酸菌耐鹽）以及salt tolerance（耐鹽）為主題進(jìn)行檢索（截止到2017年7月10日），文獻(xiàn)數(shù)如圖1所示。近20 年來(lái)，研究者對(duì)耐鹽相關(guān)的研究快速增多，自2011年以來(lái)，每年發(fā)表論文超過(guò)2 000 篇，生物耐鹽方向已逐漸成為研究熱點(diǎn)；乳酸菌耐鹽的報(bào)道相對(duì)較少，但是相關(guān)研究也受到越來(lái)越多人的關(guān)注，每年發(fā)表論文量也呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。目前乳酸菌耐鹽研究主要集中在耐鹽菌種和保護(hù)劑篩選，以及微生物耐鹽機(jī)制的研究?？傮w來(lái)說(shuō)，關(guān)于乳酸菌耐鹽的報(bào)道只占細(xì)胞耐鹽機(jī)制研究總體中極少的一部分，而且研究還不夠深入，導(dǎo)致對(duì)于乳酸菌耐鹽機(jī)制的了解不夠。目前開(kāi)發(fā)耐鹽乳酸菌的工作仍以傳統(tǒng)的從高鹽環(huán)境篩選耐鹽菌種為主，工作量大而繁瑣；而采用基因工程等新技術(shù)手段開(kāi)發(fā)耐鹽乳酸菌具有效率高、周期短等優(yōu)點(diǎn)，因此研究乳酸菌的耐鹽分子機(jī)制具有十分重要的價(jià)值。

圖1 Web of Science分別以Lactobacillus salt tolerance以及salt tolerance為主題檢索到的文獻(xiàn)數(shù)Fig. 1 Number of publications searched in Web of Science database on Lactobacillus salt tolerance and salt tolerance, respectively

2 乳酸菌耐鹽機(jī)制

目前研究乳酸菌的耐鹽分子機(jī)制涉及到細(xì)胞內(nèi)的許多調(diào)控系統(tǒng)，現(xiàn)將已報(bào)道的各種乳酸菌對(duì)應(yīng)涉及到的各類耐鹽調(diào)控機(jī)制總結(jié)如表1所示，并圍繞此將國(guó)內(nèi)外研究綜述如下。

表1 乳酸菌耐鹽機(jī)制相關(guān)研究Table 1 Summary of studies regarding salt tolerance mechanism of LAB

2.1 相容性溶質(zhì)調(diào)控系統(tǒng)

自Brown等[22]在1972年首次提出相容性溶質(zhì)的概念以來(lái)，研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多種類的相容性物質(zhì)，如甘氨酸甜菜堿、海藻糖、脯氨酸、脯氨酸甜菜堿、四氫嘧啶、肉毒堿等[23-24]。這些溶質(zhì)通常是水溶性物質(zhì)，結(jié)構(gòu)類似，存在較多的氫鍵，能夠取代水與蛋白質(zhì)等胞內(nèi)生物大分子結(jié)合，減少細(xì)胞失水從而穩(wěn)定這些大分子的天然構(gòu)象[12]。當(dāng)細(xì)胞外滲透壓升高時(shí)，乳酸菌能夠通過(guò)積累相容性溶質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞正常的滲透壓；當(dāng)胞外的滲透壓降低時(shí)，這些相容性物質(zhì)又能夠迅速地釋放出來(lái)。盡管大部分乳酸菌會(huì)采用吸收相容性物質(zhì)這種機(jī)制來(lái)維持細(xì)胞的正常滲透壓，而且它們所采用的結(jié)合底物的能量耦合機(jī)制基本相同，但是不同乳酸菌積累的相容性分子類型以及積累機(jī)制是不同的[25-28]。已報(bào)道的主要涉及植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸乳球菌（Lactobacillus lactis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）等菌株。

圖2 Lactobacillus plantarum的滲透調(diào)節(jié)模式[27]Fig. 2 Osmoregulation modes of Lactobacillus plantarum[27]

在高滲透壓條件下，L. plantarum細(xì)胞質(zhì)中積累的主要相容性物質(zhì)是甘氨酸甜菜堿。L. plantarum自身不能合成或代謝產(chǎn)生甘氨酸甜菜堿，因此細(xì)胞對(duì)甘氨酸甜菜堿吸收和外排的相對(duì)速率決定了其胞內(nèi)甘氨酸甜菜堿的最終積累水平。甘氨酸甜菜堿的吸收和外排由多個(gè)系統(tǒng)介導(dǎo)[3]。QacT是其中最重要的一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，屬于ATP結(jié)合盒（ATP binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)子超家族的一員。該系統(tǒng)由ATP驅(qū)動(dòng)，對(duì)甘氨酸甜菜堿的親和性較強(qiáng)，對(duì)脯氨酸和其他類似物的親和性較弱[29]。如圖2所示，在正常滲透壓狀態(tài)下，L. plantarum通過(guò)QacT攝取和SES排出甘氨酸甜菜堿，二者之間維持在一個(gè)平衡狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞處于高滲透壓情況下，甘氨酸甜菜堿攝入量增加，而外排則受到抑制。當(dāng)細(xì)胞外界滲透壓低于正常細(xì)胞滲透壓時(shí)，QacT轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)被抑制，而外排系統(tǒng)被激活，甘氨酸甜菜堿首先通過(guò)一個(gè)機(jī)械力敏感通道，即SES，以較快的速度被排出胞外；接著通過(guò)一個(gè)單向EC，以緩慢速度外排，用于調(diào)整細(xì)胞膨壓；當(dāng)滲透壓低于一定程度時(shí)這些通道被關(guān)閉[4,30]。這些與相容性物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)的調(diào)控系統(tǒng)在L. plantarum鹽脅迫應(yīng)答中起到了重要作用。

研究表明L. lactis在面臨鹽脅迫時(shí)采用甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（betaine uptake system，BusA），即OpuA，運(yùn)輸甘氨酸甜菜堿，維持細(xì)胞正常滲透壓[31]。BusA作為一個(gè)操縱子編碼BusA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)家族的一員，由2 個(gè)亞基組成，其中一個(gè)亞基由2 個(gè)相同的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（nucleotide binding domain，NBD）結(jié)合在β-胱硫醚合成酶（beta-cystathionine synthase，CBS）上形成；另外一個(gè)亞基由鑲嵌在跨膜區(qū)域的兩個(gè)相同的底物結(jié)合域組成，兩個(gè)亞基分別為OpuAA和OpuABC[5,32-33]。Patzlaff等[34]通過(guò)酶動(dòng)力學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)在OpuA轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中，甘氨酸甜菜堿首先結(jié)合到底物結(jié)合域，然后通過(guò)兩步ATP與ATP酶亞基的結(jié)合反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)甘氨酸甜菜堿的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收。其中一個(gè)ATP水解釋放能量將OpuA從順式變成反式構(gòu)象，從而允許底物在細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)表面釋放；第二個(gè)ATP用于重置系統(tǒng)，即將OpuA從反式轉(zhuǎn)變回順式狀態(tài)，從而構(gòu)成一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)循環(huán)。當(dāng)細(xì)胞外滲透壓變化時(shí)，BusA轉(zhuǎn)運(yùn)甘氨酸甜菜堿的能力被激活，且其轉(zhuǎn)運(yùn)活力受到細(xì)胞質(zhì)膜兩側(cè)的離子強(qiáng)度和膜的物理性質(zhì)變化的影響。Bouvier等[6]研究表明BusA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)受到一個(gè)由busR基因編碼的調(diào)控子的調(diào)節(jié)，busR能夠與busA啟動(dòng)子的一個(gè)序列重復(fù)區(qū)域結(jié)合，抑制busA基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響細(xì)胞對(duì)甘氨酸甜菜堿的吸收；同時(shí)busR基因能夠增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)滲透壓變化的敏感性。在細(xì)胞面臨鹽脅迫同時(shí)培養(yǎng)基中甘氨酸甜菜堿匱乏的情況下，L. lacits會(huì)通過(guò)積累BusA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中迅速積累甘氨酸甜菜堿，但是過(guò)多的甘氨酸甜菜堿又會(huì)抑制busA基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)胞外甘氨酸甜菜堿濃度飽和時(shí)，busA基因的轉(zhuǎn)錄水平迅速提高，使細(xì)胞內(nèi)BusA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成水平與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累的甘氨酸甜菜堿水平相一致；這也說(shuō)明了busA操縱子能夠調(diào)節(jié)外界滲透壓，同時(shí)也能夠感受外界滲透壓的變化。這種調(diào)節(jié)機(jī)制與大腸桿菌中proU操縱子的調(diào)節(jié)機(jī)制類似。研究還發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外滲透壓升高會(huì)使busA啟動(dòng)子上的BusR蛋白被取代，緩解BusR蛋白對(duì)busA基因轉(zhuǎn)錄的抑制，從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)甘氨酸甜菜堿的轉(zhuǎn)運(yùn)能力[7,35-37]。

對(duì)P. pentosaceus滲透保護(hù)研究只涉及到不同相容性物質(zhì)保護(hù)效果考察，而沒(méi)有涉及到轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)調(diào)節(jié)等方面的深入研究。Baliarda等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在含有0.8 mol/L NaCl的特定培養(yǎng)基中分別添加甘氨酸甜菜堿、二甲基乙酸噻亭（硫代甜菜堿）、膽堿、脯氨酸或肉毒堿，均能夠緩解鹽脅迫P. pentosaceus生長(zhǎng)的抑制。在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)這5 種相容性物質(zhì)時(shí)，其他4 種化合物和甘氨酸甜菜堿之間能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)運(yùn)競(jìng)爭(zhēng)，因此推測(cè)P. pentosaceus中可能存在一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)這5 種物質(zhì)。研究還發(fā)現(xiàn)P. pentosaceus和L. plantarum在特定培養(yǎng)基中的耐鹽能力相差不大，且二者在鹽脅迫下細(xì)胞內(nèi)積累的相容性溶質(zhì)種類也相似，不同的是肉毒堿對(duì)P. pentosaceus在鹽脅迫下生長(zhǎng)的影響相對(duì)L. plantarum較弱。對(duì)P. pentosaceus相容性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制有待更深一步的研究。

2.2 糖酵解關(guān)鍵酶調(diào)控系統(tǒng)

乳酸菌主要通過(guò)相對(duì)簡(jiǎn)單的代謝途徑使底物磷酸化產(chǎn)生細(xì)胞代謝所需要的能量（ATP）：糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）途徑和磷酸酮解酶（phosphoketolase，PK）途徑。對(duì)于乳酸桿菌屬，根據(jù)其不同的代謝發(fā)酵方式，可以將其分為3 種類型。Ⅰ型乳酸桿菌是專一性的同型乳酸發(fā)酵，通過(guò)EMP途徑將己糖（如葡萄糖）發(fā)酵形成乳酸鹽，但不能代謝戊糖和葡萄糖酸鹽。Ⅱ型乳酸桿菌是兼性異型乳酸發(fā)酵，可通過(guò)EMP將己糖轉(zhuǎn)化為乳酸，也可被誘導(dǎo)產(chǎn)生磷酸酮酶，催化戊糖產(chǎn)生乳酸和乙酸。Ⅲ型乳酸桿菌是專一性的異型乳酸發(fā)酵，通過(guò)PK途徑將己糖代謝形成乳酸、乙醇或乙酸和二氧化碳。EMP反應(yīng)是這些代謝途徑中最重要的第一步反應(yīng)[38]。代謝途徑中的關(guān)鍵酶為磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）、果糖二磷酸醛縮酶（fructosediphosphate aldolase，F(xiàn)BA）、磷酸甘油酸激酶（phosphoglyceric kinase，PGK）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）[9]。另外，乳酸菌從胞外吸收糖分子，進(jìn)行EMP時(shí)，糖類物質(zhì)必須經(jīng)過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphoenolpyruvate phosphotransferase system，PTS），被磷酸化后才能被菌體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中參與糖代謝，其中的某些組分在細(xì)胞面臨滲透脅迫、調(diào)節(jié)胞內(nèi)代謝、減少細(xì)胞損傷等過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[10,39]。

EMP是乳酸菌生成乳酸的主要途徑，基因pfk、fba、pgk、ldh對(duì)應(yīng)所編碼的蛋白酶均是乳酸菌EMP途徑中的關(guān)鍵酶。有研究表明基因pfk、fba、pgk、ldh均受培養(yǎng)基中NaCl的誘導(dǎo)而表達(dá)上調(diào)，并且NaCl濃度越高，基因受誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)越顯著。乳酸菌培養(yǎng)基（de Man，Rogosa and Sharpe broth，MRS）中的NaCl造成菌體外部滲透壓變大，這會(huì)對(duì)基因pfk、fba、pgk、ldh編碼的蛋白分子結(jié)構(gòu)有一定破壞作用[9]。為保護(hù)自身不受破壞，乳酸菌中與EMP相關(guān)的一系列關(guān)鍵酶受到高滲透壓脅迫的誘導(dǎo)，相應(yīng)基因表達(dá)上調(diào)，保證了EMP途徑高效進(jìn)行，以適應(yīng)不利環(huán)境[11]。Prasad等[12]對(duì)高滲條件處理后的細(xì)胞提取物進(jìn)行液質(zhì)分析，與對(duì)照組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的甘油量較少，而單糖、二糖、三糖等小分子糖的量較多，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)的許多大分子的還原性末端被甘油基團(tuán)修飾。在脫水條件下，甘油分子修飾多糖將增加糖類等大分子中可用的羥基數(shù)，增強(qiáng)細(xì)胞大分子之間（通過(guò)氫鍵）的相互作用進(jìn)而保護(hù)大分子，可提高高滲條件下菌體細(xì)胞的穩(wěn)定性[40]。

2.3 熱休克蛋白調(diào)控系統(tǒng)

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是細(xì)胞中普遍存在的ATP依賴性分子伴侶，在細(xì)胞中的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制中起關(guān)鍵作用。HSP能夠防止各種非天然底物蛋白質(zhì)的聚集或失活，通過(guò)自身或在其他ATP依賴性分子伴侶的幫助重新折疊這些底物，修復(fù)受損的蛋白質(zhì)分子，在細(xì)胞脅迫應(yīng)答中扮演了重要角色。在Lactobacillus rhamnosus中應(yīng)激蛋白GroEL和DnaK可作為分子伴侶，以短暫的非共價(jià)方式與蛋白底物結(jié)合，阻止蛋白前體折疊，促進(jìn)體內(nèi)蛋白正確合成[41-42]。同時(shí)GroEL能夠作為RNA分子伴侶保護(hù)mRNA，防止其被核酸酶降解[43-44]；GroEL和DnaK上調(diào)后能夠保護(hù)細(xì)胞內(nèi)蛋白和其他大分子，防止由環(huán)境脅迫誘導(dǎo)造成的細(xì)胞大分子損傷和降解[13-14]。

在L. lactis中，編碼DnaK的結(jié)構(gòu)基因位于orf1-grpE-dnaK操縱子上[16]。DnaK操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域中存在兩個(gè)與分子伴侶表達(dá)相關(guān)的反向重復(fù)序列（controling inverted repeat of chaperone expression，CIRCE）調(diào)控元件，其中一個(gè)CIRCE元件位于GroEL操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域中[15]。在各種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和藍(lán)細(xì)菌的熱休克基因的啟動(dòng)子區(qū)域中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CIRCE元件，例如DnaK、GroEL和GroES[45]。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌的orf39-grpE-dnaK操縱子中的orf39編碼阻遏蛋白，結(jié)合CIRCE元件，并且負(fù)責(zé)基因的熱休克控制[46-47]。目前尚不清楚阻遏物的DNA結(jié)合活性如何隨溫度的升高而改變。負(fù)責(zé)CIRCE元件的熱應(yīng)激調(diào)控基因HrcA與L. lacits的DnaK操縱子中orf1基因同源[16]。因此，研究者推測(cè)在L. lactis中的DnaK，GroEL和GroES的表達(dá)會(huì)受到由orf1基因編碼阻遏物的控制。在乳球菌的鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)過(guò)程中，高滲透壓會(huì)使細(xì)胞質(zhì)壁分離，水分活度降低，從而導(dǎo)致變性蛋白的積累，進(jìn)而誘導(dǎo)HSP調(diào)控系統(tǒng)來(lái)保護(hù)細(xì)胞內(nèi)蛋白和其他大分子，防止由鹽脅迫造成的細(xì)胞損傷[48]。

2.4 胞內(nèi)離子平衡

高滲透壓條件下，細(xì)菌內(nèi)Na＋的調(diào)節(jié)主要依賴于Nha。該蛋白屬于次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)子，位于原核生物的細(xì)胞質(zhì)膜上，能夠促進(jìn)Na＋的排出和質(zhì)子的進(jìn)入，同時(shí)參與維持胞內(nèi)正常滲透壓和酸堿環(huán)境。從反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)上分，Na＋轉(zhuǎn)運(yùn)可以分為2 類系統(tǒng)：一類為由6 個(gè)或7 個(gè)基因編碼的異源低聚體，另一類為單基因編碼形成的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。NhaA即為大腸桿菌中主要的Na＋/H＋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由單基因編碼，負(fù)責(zé)Na＋和Li＋的運(yùn)輸，對(duì)于pH值變化極其敏感，每2 個(gè)質(zhì)子可以交換轉(zhuǎn)運(yùn)2個(gè)Na＋或Li＋，能夠提高細(xì)胞的高滲透壓耐性[49-51]。NhaB是另外一個(gè)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)非常重要的反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，每3 個(gè)質(zhì)子可以交換2 個(gè)Na＋。NhaC和NhcD是另外2 個(gè)單基因產(chǎn)物家族的反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其初級(jí)結(jié)構(gòu)與NhaA和NhaB相差較大，相關(guān)生理功能還有待進(jìn)一步研究[52]。另外有研究發(fā)現(xiàn)在海洋紅嗜熱鹽球菌（Rhodothermus marinus）中存在一個(gè)新的Na＋/H＋反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NhaE，位于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）-醌氧化還原酶（NADH-quinone oxidoreductase，Nqo）復(fù)合物中，是呼吸鏈的一部分，在Nqo參與呼吸作用時(shí)可將胞內(nèi)的Na＋轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外[53]。

當(dāng)細(xì)胞受到鹽脅迫時(shí)，除了外排Na＋，細(xì)胞通常還會(huì)增加對(duì)K＋的吸收，恢復(fù)Na＋/K＋比，從而恢復(fù)胞內(nèi)水和離子平衡。K＋跨細(xì)胞膜運(yùn)動(dòng)涉及到維持細(xì)胞滲透壓和調(diào)節(jié)細(xì)胞pH值，可以激活細(xì)胞生理代謝過(guò)程中的各種酶類，參與蛋白質(zhì)合成代謝過(guò)程[54]。綠膿桿菌中存在的Ktr依賴于兩種K＋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。一種是由PA5021基因編碼的PA5021蛋白，在高鹽環(huán)境下細(xì)胞向外轉(zhuǎn)運(yùn)Na＋和K＋過(guò)程中起到了重要作用，同時(shí)K＋的轉(zhuǎn)運(yùn)可能也與依賴于呼吸作用的Na＋轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)；另一種是由PA1207基因編碼的PA1207蛋白，參與細(xì)胞對(duì)K＋的吸收過(guò)程[55]。同時(shí)，Nakamura等[56]發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）中存在Ktr，KtrA是一個(gè)結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)膜外周的一個(gè)膜亞基結(jié)構(gòu)單位，KtrB是一個(gè)完整的膜亞基結(jié)構(gòu)單位，參與K＋的運(yùn)輸。而之后又在枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了分別與KtrA和KtrB同源的蛋白KtrA、KtrC和KtrB、KtrD，相應(yīng)地組成了與K＋親和性比較高的KtrAB和與K＋親和性相對(duì)較低的KtrCD轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，在二者協(xié)同作用下幫助細(xì)胞抵抗外界滲透壓[57]。

目前與乳酸菌中K＋轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的研究罕有報(bào)道。在海氏腸球菌（Enterococcus hirae）中報(bào)道的K＋轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制有KtrⅠ和KtrⅡ兩種。KtrⅠ能夠結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)K＋和Rb＋，但是二者的運(yùn)輸都需要跨細(xì)胞膜形成的質(zhì)子勢(shì)和ATP驅(qū)動(dòng)。而KtrⅡ不依賴于質(zhì)子勢(shì)，只在高濃度Na＋存在下被激活。研究發(fā)現(xiàn)KtrⅡ轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中，K＋的吸收與Na＋-ATP酶形成Na＋電化學(xué)勢(shì)能有關(guān)，能夠特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)K＋[17,58]。這些Na＋、K＋轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)能夠使乳酸菌在滲透脅迫時(shí)迅速恢復(fù)胞內(nèi)的離子平衡，降低鹽脅迫對(duì)細(xì)胞造成損傷。

2.5 其他胞內(nèi)代謝途徑

乳酸菌在受到鹽脅迫時(shí)，菌體除了通過(guò)各種代謝途徑對(duì)滲透壓的變化作出反應(yīng)，同時(shí)必須調(diào)節(jié)胞內(nèi)代謝平衡，維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。鹽脅迫條件也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷，造成細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂。已知NaCl是一種有效的促氧化劑，可以誘導(dǎo)與非典型條件相適應(yīng)的蛋白質(zhì)的表達(dá)。Belベore等[19]在Lactobacillus sakei CRL1756中研究發(fā)現(xiàn)，涉及非典型條件（假定的類鐵蛋白樣DNA結(jié)合蛋白，LSA1782）以及與無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒過(guò)程（含鐵染料脫色過(guò)氧化物酶，LSA1831）有關(guān)的2 種蛋白質(zhì)在0.1 g/mLNaCl環(huán)境中是過(guò)表達(dá)的。類鐵蛋白樣DNA結(jié)合蛋白是饑餓細(xì)胞DNA結(jié)合蛋白（DNA-binding protein from starved cells，Dps）家族的成員，可以形成DNA-Dps共晶體，以保護(hù)DNA免受損傷環(huán)境的影響，而染料脫色過(guò)氧化物酶參與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶以及過(guò)氧化氫解毒過(guò)程的調(diào)節(jié)[59-60]。由于腌肉等肉制品是富含鐵的底物，活性氧可以通過(guò)酶促反應(yīng)或自發(fā)產(chǎn)生[18]，因此L. sakei CRL1756在這些肉制品上生長(zhǎng)過(guò)程中，類鐵蛋白樣DNA結(jié)合蛋白會(huì)被誘導(dǎo)來(lái)應(yīng)對(duì)高鹽對(duì)細(xì)胞造成的氧化脅迫[19]。

鹽脅迫也誘導(dǎo)了L. sakei CRL1756中的腺苷酸琥珀酸合酶purA的合成，參與核苷酸代謝，核苷酸的積累可用于進(jìn)一步合成DNA、RNA和ATP，確保細(xì)菌在脅迫條件下的存活。類似地，L. lacits中涉及嘌呤代謝的一種蛋白（bifunctional purine biosynthesis protein，PurH）在5 mol/LNaCl條件下表達(dá)上調(diào)，L. lacits在滲透脅迫條件下完成了從糖酵解到嘌呤生物合成的碳轉(zhuǎn)移[20]。在L. sakei CRL1756鹽脅迫還觀察到基因fab1（負(fù)責(zé)編碼烯?；d體蛋白）和argS（負(fù)責(zé)編碼參與脂肪酸和氨基酰-tRNA生物合成的精氨酰RNA合成酶）的下調(diào)，這些基因在L. lacits中也被報(bào)道在高滲條件下受到抑制，這些與脂肪酸代謝途徑相關(guān)的基因也參與了高滲條件下細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)[19,21]。

Li Yu等[61]研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加外源性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，能夠提高乳酸乳球菌對(duì)NaCl等許多脅迫環(huán)境的抗性，而對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有負(fù)面影響。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，外源添加的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶參與了細(xì)胞壁的合成，并且這種產(chǎn)生多種抗性表型的菌株是特異性的，它只發(fā)生在肽聚糖中存在谷氨酰胺與賴氨酸基團(tuán)相連接的細(xì)菌中。此外，細(xì)胞面對(duì)不同的環(huán)境脅迫可能會(huì)產(chǎn)生交叉性應(yīng)激反應(yīng)，比如在酸脅迫下干酪乳桿菌中表達(dá)量顯著上調(diào)的DNA修復(fù)蛋白R(shí)ecO，通過(guò)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入L. Lactis并且在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)后，能夠提高重組菌株耐鹽等特性[62]；Gonzalez等[63]研究報(bào)道用一些溫和的高溫、過(guò)氧化氫或乙醇脅迫條件預(yù)處理乳酸乳球菌后能夠提高其在含有0.05 g/mL NaCl培養(yǎng)基中的存活率，但均未涉及到耐鹽機(jī)制方面的研究。

3 結(jié) 語(yǔ)

乳酸菌耐鹽機(jī)制的研究是目前食品科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。迄今為止，研究者分別從相容性溶質(zhì)調(diào)控系統(tǒng)、糖酵解關(guān)鍵酶調(diào)控系統(tǒng)、HSP調(diào)控系統(tǒng)、胞內(nèi)離子平衡和其他一些代謝系統(tǒng)，詳細(xì)地闡釋了不同來(lái)源的乳酸菌在高鹽脅迫下的調(diào)節(jié)機(jī)制，這對(duì)于開(kāi)發(fā)耐鹽乳酸菌和尋找合適的鹽脅迫保護(hù)物質(zhì)具有重要的意義，為乳酸菌能更好地應(yīng)用到發(fā)酵食品工業(yè)提供了理論依據(jù)。但由于乳酸菌種類繁多，生存環(huán)境復(fù)雜多變，乳酸菌在鹽脅迫下的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制有待更全面深入的研究。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大數(shù)據(jù)時(shí)代的來(lái)臨，運(yùn)用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)相結(jié)合的方法，通過(guò)生物信息學(xué)分析，將使乳酸菌耐鹽機(jī)制得到全方位的闡釋，并更好地服務(wù)于發(fā)酵食品生產(chǎn)。

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