王丹丹 陳剛 葉俏 鮑軼 官俏兵
骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕卣鞯年P(guān)節(jié)疾病,它是導(dǎo)致老年人慢性肌肉骨骼疼痛和活動障礙的最主要原因,但是目前關(guān)于OA的發(fā)病機制尚未完全清楚。微小RNA(miRNA)是一類小分子非編碼RNA,具有保持和調(diào)節(jié)人體正常生理功能的重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA異常表達與OA的發(fā)生密切相關(guān)[1],但關(guān)于miR-34b在OA中的生理功能和潛在的分子機制尚不明確。故本研究檢測miR-34b在OA軟骨細胞中的表達,通過轉(zhuǎn)染miR-34b的模擬物或抑制物調(diào)節(jié)軟骨細胞內(nèi)miR-34b的表達量,探索其對軟骨細胞基質(zhì)代謝和Smad3表達的影響;同時檢測miR-34b是否直接靶向Smad3,進而初步解釋miR-34b在OA發(fā)病機制中的作用,為OA的預(yù)防與治療提供新的切入點。
1.1 標(biāo)本來源 標(biāo)本來自2014年6月至2015年10月本院骨科收治的住院患者。OA軟骨組織標(biāo)本取自10例行全膝關(guān)節(jié)置換的OA患者(依據(jù)美國風(fēng)濕病協(xié)會OA診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為膝關(guān)節(jié)終末期OA[2])的膝關(guān)節(jié),排除有糖尿病、骨骼發(fā)育障礙性疾病、其他類型關(guān)節(jié)炎、腫瘤、感染、其他慢性炎癥性疾病以及糖皮質(zhì)激素治療史者。正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織標(biāo)本取自7例因車禍而截肢患者的膝關(guān)節(jié),排除有糖尿病、關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)功能受限、其他類型關(guān)節(jié)炎罹患史、惡性腫瘤以及糖皮質(zhì)激素治療史者。本實驗使用的人軟骨組織標(biāo)本符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則,標(biāo)本采集取得所有患者的知情同意。
1.2 儀器及試劑 人軟骨肉瘤細胞株SW1353購自中國科學(xué)院細胞庫;DMEM/F12培養(yǎng)基、FBS、青霉素、鏈霉素均購自美國Gibco公司;胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶均購自美國sigma公司;Lipofectamine 2000、Trizol試劑均購自美國Invitrogen公司;實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-qPCR)試劑盒購自日本Toyobo公司;2×Taq PCR Master Mix購自美國Applied Biosystems公司;經(jīng)過特殊化學(xué)修飾的miR-34b模擬物(miR-34b mimic)、miR-34b抑制物(miR-34b inhibitor)、無義序列均購自廣州銳博生物公司;PCR儀購自美國Biometra公司;恒溫CO2培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司。
1.3 軟骨細胞的分離、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將收集的OA軟骨組織和正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織置于無菌培養(yǎng)皿,0.25%的胰蛋白酶37℃消化30min,PBS清洗;剪碎軟骨組織至1mm×1mm×1mm大小,加0.2%的Ⅱ型膠原酶,置搖床上37℃消化5h;過濾器過濾,收集濾液,離心收集細胞;將細胞懸浮于含10%FBS、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中。SW1353細胞用含有10%FBS、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2d更換1次培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染時SW1353細胞接種在6孔板內(nèi),待80%細胞匯合后用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染,參照說明書進行操作。實驗設(shè)4組:空白對照組(只加入等量的脂質(zhì)體,A組)、SW1353細胞轉(zhuǎn)染無義序列組(B組)、SW1353細胞轉(zhuǎn)染miR-34b mimic組(C組)、SW1353細胞轉(zhuǎn)染miR-34b inhibitor組(D組)。
1.4 RT-qPCR 引物設(shè)計及合成委托英駿生物技術(shù)有限公司進行,各基因的引物序列見表1。以Trizol試劑、氯仿提取軟骨細胞的總RNA,異丙醇沉淀回收RNA,75%乙醇洗滌RNA沉淀。取≤1μg的RNA,以各基因引物片段為特異引物,用ReverTra Ace-α-試劑盒合成cDNA。PCR反應(yīng)條件:94℃ 5min;然后進入94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 1min的循環(huán)(共40次)。以β-actin和 U6分別作為mRNA和miRNA的內(nèi)參,計算機分析Ct值,采用2-△△Ct法計算相對表達量,即miR-34b表達水平。
表1 RT-qPCR反應(yīng)引物序列
1.5 熒光素酶報告基因?qū)嶒?使用Targetscan基因信息軟件預(yù)測得到Smad3是miR-34b靶基因,構(gòu)建Smad3 野生型及突變型 3′非編碼區(qū)(3′-UTR)-熒光素酶報告載體,利用熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-34b對Smad3基因野生型及突變型3′-UTR熒光素酶活性的影響。293T細胞使用DMEM/F12培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng);將熒光素酶報告載體與miR-34b mimic及對照組無義序列共轉(zhuǎn)染293T細胞,36h后收獲細胞;使用熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。
1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 OA軟骨組織與正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織中miR-34b表達水平比較 OA軟骨組織中miR-34b表達水平(2.79±1.94)明顯高于正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織(0.11±0.17),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
2.2 SW1353細胞轉(zhuǎn)染后miR-34b表達水平 SW1353細胞轉(zhuǎn)染后,與A組miR-34b表達水平(0.12±0.19)比較,C 組(3.79±0.11)明顯升高,D 組(0.01±0.03)明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);A組與B組(0.11±0.18)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。
2.3 熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果 經(jīng)生物信息學(xué)軟件預(yù)測,Smad3是miR-34b的潛在靶基因。熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實,共轉(zhuǎn)染miR-34b mimic與pMiR-ReportTM-Smad3野生型3′-UTR質(zhì)粒后,熒光強度較轉(zhuǎn)染無義序列、pMiR-ReportTM-Smad3 野生型 3′-UTR質(zhì)粒均明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);共轉(zhuǎn)染 miR-34b mimic與pMiR-ReportTM-Smad3突變型3′-UTR質(zhì)粒后,熒光強度與轉(zhuǎn)染無義序列、pMiRReportTM-Smad3 突變型 3′-UTR 質(zhì)粒比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05);提示miR-34b可特異性地與Smad3的3′-UTR結(jié)合。RT-qPCR法進一步檢測轉(zhuǎn)染miR-34b mimic和 miR-34 inhibitor后 Smad3基因mRNA 表達水平,與A 組(0.51±0.12)比較,C組(0.07±0.04)明顯降低,D 組(1.12±0.06)明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均 P<0.05);A 組與 B 組(0.52±0.08)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
2.4 轉(zhuǎn)染后SW1353細胞中Ⅱ型膠原、MMP-13的mRNA表達水平 轉(zhuǎn)染后,與A組比較,C組Ⅱ型膠原mRNA表達水平明顯降低,D組明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);C組MMP-13 mRNA明顯升高,D組明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),見表2。
表2 4組不同條件下細胞的Ⅱ型膠原、MMP-13 mRNA表達水平比較
早期診斷、早期治療OA具有重要的臨床意義。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA,普遍存在于在動物和植物中,在基因表達方面有重要的調(diào)控作用。miRNA通過與靶mRNA的3′-UTR結(jié)合,進而降解靶mRNA或抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后翻譯,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生成,從而發(fā)揮效應(yīng)[3-4]。在生物發(fā)育的不同階段,miRNA對細胞的增殖、分化和凋亡等過程均有影響,因此它能對機體發(fā)育、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的保持和骨代謝等過程進行調(diào)解[5-6]。miRNA異常表達可能會引起OA,如Iliopoulos等[7]發(fā)現(xiàn)人OA軟骨細胞內(nèi)miR-140表達水平明顯下降,Miyaki等[8]通過構(gòu)建miR-140基因缺失小鼠,成功誘導(dǎo)出以蛋白多糖丟失、關(guān)節(jié)軟骨纖維化為特征的OA樣改變。因此,確定OA中miRNA發(fā)揮作用的分子機制非常重要。本實驗結(jié)果證實,OA軟骨細胞中miR-34b表達水平較正常軟骨細胞明顯增加。
miRNA需要通過與其靶基因相互作用,從而發(fā)揮調(diào)節(jié)基因表達的功能。因此,首先要尋找miR-34b靶基因。筆者使用Targetscan基因信息軟件預(yù)測,發(fā)現(xiàn)Smad3 mRNA的3′UTR中含有與miR-34b互補結(jié)合的序列。進一步作熒光素酶報告基因?qū)嶒?,證實Smad3是miR-34b的直接靶基因,且在SW1353細胞中過表達miR-34b后,Smad3 mRNA表達水平明顯下調(diào)。以上結(jié)果表明Smad3是miR-34b的功能介導(dǎo)者。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路在軟骨細胞的分化、增殖和成熟以及軟骨基質(zhì)的合成中具有重要的調(diào)節(jié)作用,TGF-β信號通路異常與OA的發(fā)生密切相關(guān)[9]。Smad3是連接細胞外TGF-β信號的細胞內(nèi)分子,在缺乏Smad3的小鼠中可觀察到OA癥狀[10]。另外,過表達的Smad3會提高軟骨形成過程中軟骨細胞的生長和分化,下調(diào)Smad3會減弱這個過程[11]。本實驗結(jié)果顯示,miR-34b可能通過抑制Smad3的活性,從而影響TGF-β信號通路,促進軟骨細胞分解代謝,加速軟骨基質(zhì)降解,最后導(dǎo)致OA。
本研究進一步驗證miR-34b在OA發(fā)病機制中的作用,即轉(zhuǎn)染miR-34b mimic或inhibitor上調(diào)或抑制SW1353細胞中miR-34b的表達后,利用RT-qPCR檢測Ⅱ型膠原mRNA表達水平。實驗結(jié)果顯示miR-34b mimic轉(zhuǎn)染后,Ⅱ型膠原mRNA表達下調(diào),而miR-34b inhibitor會上調(diào)Ⅱ型膠原mRNA表達。以上結(jié)果提示miR-34b可以抑制軟骨細胞的合成代謝能力。MMP-13在OA的發(fā)病機制中具有重要作用[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)軟骨細胞轉(zhuǎn)染miR-34b mimic時,MMP-13 mRNA表達水平明顯升高;轉(zhuǎn)染miR-34b inhibitor時,MMP-13 mRNA表達水平明顯下降。前期相關(guān)研究報道在人和鼠軟骨細胞中,降低Smad3表達水平會導(dǎo)致MMP-13表達水平升高[13]。以上結(jié)果表明,miR-34b可能通過靶向抑制Smad3的表達,從而促進軟骨細胞基質(zhì)的分解代謝。
綜上所述,miR-34b在OA軟骨細胞中表達明顯上調(diào);miR-34b可能通過靶向調(diào)節(jié)Smad3的表達,誘導(dǎo)人關(guān)節(jié)軟骨細胞基質(zhì)退變,進而促進OA的發(fā)展。關(guān)節(jié)軟骨細胞中miR-34b的功能研究可為OA的預(yù)防與治療提供新的切入點,建議多關(guān)注其影響軟骨基質(zhì)代謝的分子機制研究,這可能為OA的防治開拓新的領(lǐng)域。
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