高樹峰 張克輝 游龍貴 劉遺斌 羅冬 黃振河 王心濤

[摘要]目的 探討鈣網(wǎng)蛋白（CRT）在人喉癌細胞中的表達及臨床意義。方法 應(yīng)用熒光定量PCR（RT-PCR）、蛋白印記（Western blot）檢測CRT在mRNA與蛋白水平上的差異性變化。結(jié)果 喉癌組織CRT的mRNA和蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），CRT mRNA表達升高67%，CRT蛋白表達升高71%。結(jié)論 CRT可能參與了喉癌的發(fā)生、發(fā)展過程，CRT可能是喉癌一個潛在的基因治療靶點。

[關(guān)鍵詞]鈣網(wǎng)蛋白；喉癌細胞；臨床意義

[中圖分類號] R739.65 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）12（a）-0026-04

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，以40～60歲男性多見，近年來發(fā)病率有明顯增高的趨勢，其腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個漸進過程，具體的疾病發(fā)生機制尚未完全知悉，多數(shù)研究顯示腫瘤細胞的凋亡受阻可能與其疾病的發(fā)生、發(fā)展有相關(guān)性。鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）為細胞表面的一種重要標志物，研究顯示，其在許多惡性腫瘤中均有表達狀態(tài)，且在調(diào)控腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1-2]。本研究應(yīng)用熒光定量PCR（RT-PCR）、蛋白印記（Western blot）檢測CRT在mRNA與蛋白水平上的差異性變化，探討CRT基因在人喉癌細胞中的表達及臨床意義，旨在為喉癌的基因治療提供有效的備選靶標之一，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞及主要試劑 從喉癌組織懸液提取的人喉癌上皮細胞；胎牛血清（NycoPrep公司）；HRP標記的優(yōu)質(zhì)內(nèi)參（上?？党缮铮籆RT抗體abcam；RIPA裂解液[碧云天（北京）]；Goat Anti-Rabbit IgG[Southern Biotechnology，Inc（USA）]；SDS-PAGE試劑[Abcam，Inc（UK）]；Peroxidase-Rabbit Anti-Rat IgG[博士德生物（武漢）]；定量PCR用的SYBR Green qPCR SuperMix（Invitrogen）。

1.1.2主要儀器 流式細胞儀[BD Inc（USA）]；定量PCR用的SYBR Green qPCR SuperMix[Invitrogen Inc（USA）]；倒置熒光顯微鏡[Leica Inc（Germany）]；細胞恒溫培養(yǎng)箱[Thermo Fisher Scientific Inc（USA）]。

1.2主要實驗方法

1.2.1單細胞懸液制備 取少量喉癌組織約0.5 g置于勻漿器中，清洗后仔細剔除脂肪、壞死組織、纖維及結(jié)締組織；用干凈的組織剪將組織充分剪小、剪碎并不斷輕微揉搓，置120目不銹鋼網(wǎng)上，然后邊輕搓邊用純凈水不斷沖洗，靜置待自然沉淀后收集喉癌組織細胞混懸液；將混懸液用300目尼龍細網(wǎng)再次過濾，靜置后收集細胞懸液。將此懸液置于離心機1200 r/min，離心2～5 min，棄上清液后再次1200 r/min離心2 min，棄上清液后加入1 ml PBS將細胞懸浮，記數(shù)并調(diào)整細胞濃度為1×106/ml。

1.2.2 RT-PCR 按照TRIzol的操作說明對組織蛋白進行RNA提取，用紫外分光光度儀進行總RNA定量后，按逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄體系推薦的2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄，并用于做q-PCR。使用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物，β-actin為內(nèi)參照；β-actin-F：5′-TGCATGAGGATGCAGCAGTT-3′，β-actin-R：5′-TCCGCGACAATGTGATCTTA-3′；擴增片段大小：β-actin為235 bp；CRT-F：5′-CTAGATGAGTTGAAGCAGTG-3′，CRT-R：5′-CGGGATCTAATATGTGTCTC-3′；目的片段：CRT為225 bp。以（Oligo）dT作為引物據(jù)序列互補原則，利用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成cRNA第一鏈后，取5 μl cRNA為模板再進行PCR擴增；PCR管中依次加入第一鏈cRNA、上游下游引物各5 μl、2xSYBR Green qPCR SuperMix 10 μl、Dntp5 10μl、Taq酶（2 U/10 μl）210 μl，適量ddH2O加至共體積20 μl，輕輕混合均勻離心，設(shè)定參數(shù)后在實時熒光定量PCR儀上擴增，行瓊脂糖凝膠電泳后查看試驗結(jié)果。設(shè)置以喉癌組織標本細胞作為試驗的實驗HEP2-A組，與來自未經(jīng)任何處理的正常機體細胞作為試驗的對照HEP2-B組。反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 32 s讀板，40 cycles。

1.2.3 Western blotting 根據(jù)制備的細胞懸液喉癌細胞量加入相應(yīng)RIPA裂解液，勻漿置冰，裂解30 min后（過程中要經(jīng)常指彈便于充分裂解）常規(guī)提取細胞蛋白行蛋白的初步定量分析；取樣品50 μg，與上樣緩沖液按2∶1混合，沸水浴5 min充分混合均勻；配制4%的濃縮膠，經(jīng)SDS-PAGE電泳（80 V恒壓50 min，或60 V轉(zhuǎn)移2 h，或40 V轉(zhuǎn)移3 h，轉(zhuǎn)完出現(xiàn)溴酚藍剛出膠底部止）、轉(zhuǎn)膜至常規(guī)PVDF膜，5%的脫脂奶粉TBST溶液封閉1 h，一抗4℃過夜、二抗37℃孵育1 h，TBST液洗滌5 min×3次，加入Immobilon Western Chemilum HRP Substrate，雜交膜表面上反應(yīng)5 min，去盡殘夜，濾紙吸凈多余底物溶液，備好1×顯影液和定影液，于暗室中曝光、顯影、定影。同時設(shè)置以β-actin為內(nèi)參照，同樣以喉癌組織標本細胞作為試驗的實驗組，而來自未經(jīng)任何處理的正常機體細胞作為對照組；應(yīng)用凝膠圖像處理分析系統(tǒng)軟件進行圖像掃描分析。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩數(shù)據(jù)比較采用t檢驗或單向方差分析，多組間數(shù)據(jù)比較采用F檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2結(jié)果

2.1 RT-PCR

試驗樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，通過分析5、15、20 s rRNA 3條帶譜，其完整性系數(shù)提示純度檢測無蛋白污染；完整性檢測Total RNA抽提完整（圖1）。結(jié)果顯示，CRT mRNA于喉癌細胞mRNA表達有明顯升高，實驗HEP2-A組的表達陽性率升高67%，高于設(shè)置的對照HEP2-B組（t=3.20，P<0.05），CRT-mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義（F=31.17，P<0.05）（表1）。

2.2 Western blotting

分別將對照組、實驗組提取細胞蛋白并檢測細胞CRT蛋白表達水平，結(jié)果顯示，與對照組比較，實驗組目的基因在喉癌細胞中有顯著的蛋白表達提升，經(jīng)過對其灰度分析后顯示目的蛋白在喉癌細胞中較對照組提升71%CRT的表達；而非靶向蛋白β-actin的表達無影響；分析CRT蛋白表達率與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖2）。

3討論

CRT最初被認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）上的鈣離子結(jié)合蛋白，其進化過程中具有高度保守性，最初是從兔骨骼肌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離提取而來；近年研究發(fā)現(xiàn)其在細胞外也有表達，其蛋白由單基因編碼，具有多種生物學功能，包括蛋白加工、細胞內(nèi)鈣離子的調(diào)節(jié)、抑制瘤體血管增生和參與抗原遞呈及腫瘤瘤體細胞凋亡等各項功能。另外，CRT在腫瘤胞膜穩(wěn)定完整的表達可促進某些腫瘤的免疫原性凋亡，使腫瘤細胞對凋亡信號刺激的感受性增強[3]。在腫瘤的實際治療過程中，免疫治療與化療往往很難很好地結(jié)合在一起，患者經(jīng)過幾個療程的化療之后，體內(nèi)大量的免疫效應(yīng)器被破壞，所以針對腫瘤的抗原免疫反應(yīng)在體內(nèi)很難產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)CRT過度表達的腫瘤細胞對放、化療而誘發(fā)的胞體凋亡更顯敏感，在細胞表面被作為凋亡細胞的標志，可以作為信號刺激因子被吞噬細胞識別和吞噬，從而引起腫瘤細胞的免疫原性凋亡；還可通過阻止Akt信號轉(zhuǎn)導、改變Ca2+穩(wěn)態(tài)來調(diào)節(jié)P53功能，以調(diào)整其誘發(fā)細胞凋亡[4]。此外，凋亡腫瘤細胞表面的CRT還可能被抗原呈遞細胞-樹突狀細胞識別，從而促進清除凋亡細胞，參與抗原提呈和活化特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)[5]。近年來的研究顯示，CRT從細胞的ER移位到胞膜是凋亡細胞免疫原性的重要標志，這種生物學上的轉(zhuǎn)移決定特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，利于腫瘤的優(yōu)化性治療，提示CRT與E6或E7聯(lián)合的疫苗均使置瘤的荷瘤實驗小鼠產(chǎn)生了抗E6或E7的顯著T細胞特異性免疫應(yīng)答[6-8]。CRT的表達促進腫瘤細胞的主動性免疫原性死亡，有利于清除殘瘤腫瘤細胞，這為以后的抗腫瘤治療提供了一種可能有效的免疫治療新靶點。在臨床腫瘤診斷方面，多種腫瘤細胞表面CRT及其裂解片段較正常組織有差異性表達量的改變，這為腫瘤的診斷提供了有利的幫助，這種發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)性[9-10]，提示其可能成為新腫瘤標志物的潛在價值備選因子之一，以后有望在腫瘤的早期診斷及疾病預(yù)后判斷發(fā)揮作用。在膀胱癌的研究中，通過檢測尿中CRT發(fā)現(xiàn)其表達量也明顯增加，考慮是否將CRT作為潛在生物學標志應(yīng)用于早期診斷[9]。另外，在結(jié)腸癌、宮頸癌、神經(jīng)母細胞瘤中，尤其在高度惡性和低分化區(qū)域，CRT的高表達直接關(guān)系到腫瘤的進展，提示CRT與腫瘤細胞的生長、分化、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有直接的關(guān)系[10-11]。另用含有特異性CRT融合基因載體和含CRT的基因疫苗免疫實驗小鼠，結(jié)果觀察到荷瘤小鼠的抗瘤效應(yīng)非常明顯，并且多次試驗后發(fā)現(xiàn)其誘導并強化了荷瘤小鼠的免疫記憶細胞，這為將來的腫瘤治療性疫苗的開發(fā)研究邁出了不可或缺的關(guān)鍵一步[12-17]。

本研究中，為了進一步明確CRT在喉鱗狀細胞癌中作用，筆者將喉癌組織通過熒光定量PCR、Western blot，檢測CRT在mRNA與蛋白水平上的差異性變化。結(jié)果顯示，喉癌組織CRT的mRNA和蛋白表達水平顯著升高，初步提示CRT可能參與了喉癌的發(fā)生、發(fā)展過程，其表達上調(diào)在喉癌進展中發(fā)揮了重要的作用。

綜上所述，CRT可能是喉鱗狀細胞癌一個潛在的基因治療靶點。但是，因腫瘤的發(fā)生及發(fā)展的多因素復雜性，可能涉及相關(guān)多基因[18]，CRT單獨或聯(lián)合其他基因的綜合治療性實驗研究還有待進一步證實；CRT能否真正成為喉癌臨床治療的有效靶點，還需進一步的深入研究。

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（收稿日期：2018-09-04 本文編輯：祁海文）