程新富　傅斌

【摘要】 目的：探討CCL18與CCR8受體結(jié)合對膀胱癌5637細(xì)胞增殖和侵襲的影響，為抑制膀胱癌遷移提供實驗基礎(chǔ)。方法：檢測不同濃度CCL18下膀胱癌細(xì)胞中EMT部分標(biāo)志物的蛋白表達(dá)變化。通過轉(zhuǎn)染siRNA沉默CCL18的受體CCR8以研究對膀胱癌的生物學(xué)行為的影響及產(chǎn)生的相關(guān)變化，并進(jìn)一步觀察細(xì)胞形態(tài)、侵襲能力、腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)變化情況。結(jié)果：在不同濃度CCL18處理下，E-cadherin隨CCL18濃度增加其蛋白表達(dá)下調(diào)，而MMP-2、VEGF隨CCL18濃度增加其蛋白表達(dá)上調(diào)。沉默CCR8受體后檢測膀胱癌細(xì)胞連接變松散，細(xì)胞形態(tài)相對較圓；CCR8、MMP-2、VEGF-C的mRNA及蛋白表達(dá)水平下調(diào)，E-cadherin的mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào)；transwell結(jié)果（200倍鏡下）顯示膀胱癌細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：CCL18通過結(jié)合CCR8受體促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖與侵襲。

【關(guān)鍵詞】 膀胱癌； CCL18； CCR8受體； 細(xì)胞增殖

Effect of CCL18 Combined with CCR8 Receptor on Proliferation and Invasion of Bladder Cancer Cell Line 5637/CHENG Xinfu，F(xiàn)U Bin.//Medical Innovation of China，2017，14（35）：028-032

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of CCL18 combined with CCR8 receptor on proliferation and invasion of bladder cancer cell line 5637，and to provide an experimental basis for the inhibition of bladder cancer migration.Method：The expression of some EMT markers in bladder cancer cells under different concentrations of CCL18 was detected.Changes by transfection of siRNA silencing CCL18 receptor CCR8 in order to study the biological behavior of bladder cancer and the further observation of cell morphology and invasion related changes，tumor metastasis.Result：At different concentrations of CCL18，the expression of E-cadherin was down regulated with the increase of CCL18 concentration，while the expression of MMP-2 and VEGF was up-regulated with the increase of CCL18 concentration.Loose connection detection of bladder cancer cells after silencing CCR8 receptor，cell morphology was relatively round.mRNA and protein expression of CCR8，MMP-2 and VEGF-C levels were down regulated expression of mRNA and E-cadherin protein level increased.Transwell results（200 magnification） showed that bladder cancer cell number was significantly reduced，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：CCL18 combined with CCR8 receptor can promote the proliferation and invasion of bladder cancer cells.

【Key words】 Bladder cancer； CCL18； CCR8 receptor； Cell proliferation

First-authors address：Jingdezhen Second Peoples Hospital，Jingdezhen 333000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.35.008

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）和腫瘤浸潤樹突狀細(xì)胞（TIDCs）分泌的CCL18趨化因子是促進(jìn)多種浸潤性發(fā)展的重要原因[1-3]。利用膀胱癌與不同濃度梯度的CCL18與共培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染siRNA以沉默膀胱癌細(xì)胞上CCL18的受體CCR8后與CCL18共培養(yǎng)的方法觀察其對腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的影響。結(jié)合2015年3月-2016年5月CCL18結(jié)合CCR8受體對膀胱癌5637細(xì)胞增殖和侵襲的影響研究情況，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌5637細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，CCL18重組人蛋白購自美國Perprotech公司，多克隆兔抗人CCR8抗體購自武漢博士德生物公司工程有限公司，CCR8（human）及CCR8 siRNA、Lipo2000和E-cadherin、MMP-2、VEGF-C引物均由invitrogen公司構(gòu)建合成，Matrigel膠購自BD公司，E-cadherin一抗購自CST公司，MMP-2一抗及VEGF-C一抗購自Anbo公司，RIPA 裂解液購自美國Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國HyClone公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司，TRIzol reagent、DEPC購自invitrogen公司。在PrimerBank中根據(jù)相關(guān)引物需要查找相應(yīng)的引物，選取100～200對堿基對之間的引物送invitrogen公司構(gòu)建。endprint

1.2 方法

1.2.1 用6孔板接種膀胱癌5637細(xì)胞2×105個細(xì)胞/孔（約2 mL），培養(yǎng)12 h后。未加CCL18設(shè)為對照組（A組）；首先接受20 ng/mL的預(yù)處理多克隆兔抗人CCR8抗體4 h，然后50 ng/mL CCL18處理（B組）；接受50 ng/mL CCL18處理為（C組）；接受100 ng/mL CCL18處理為（D組），繼續(xù)培養(yǎng)36 h后。western blot檢測E-cadherin、MMP-2、VEGF-C蛋白表達(dá)變化情況。

1.2.2 細(xì)胞種板后分組：SC組（即實驗組）轉(zhuǎn)染CCR8 siRNA；NC組（即陰性對照組）轉(zhuǎn)染非特異性脂質(zhì)體；CC組（即空白對照組）未經(jīng)任何處理。實驗各組全部添加50 ng/mL CCL18，做培養(yǎng)處理。經(jīng)過6 h，放置在熒光顯微鏡下，對熒光細(xì)胞數(shù)進(jìn)行觀察，轉(zhuǎn)染效率=（熒光細(xì)胞數(shù)/同一視野白光下的細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.2.3 收集轉(zhuǎn)染24、48、72 h后以上各組細(xì)胞，使用TRIzol試劑及Invitrogen試劑，將總RNA提取出，RNA濃度的測定使用超微量分光光度儀。使用TAKARA試劑盒、qRT-PCR Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，以熒光定量PCR儀檢測，各樣品將內(nèi)參照用作β-actin基因（Actin即“肌動蛋白”，屬于細(xì)胞重要骨架蛋白），提取且反轉(zhuǎn)錄以上各組細(xì)胞的總RNA，生成cDNA，以cDNA作母版，使用2×EasyTaq PCR SuperMix來擴增PCR，循環(huán)40個。PCR以大幅增加微量DNA為最突出表現(xiàn)特征。

1.2.4 取上述各組樣品上樣20 μg，上樣完畢后，用western blot以β-actin為內(nèi)參照分別檢測E-cadherin、MMP-2、MMP-9 、CCR8的蛋白表達(dá)量。

1.2.5 Transwell檢測細(xì)胞侵襲力的改變，選擇24孔板和與其相稱的侵襲小室，將轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞加放其中，孵箱培養(yǎng)16 h后洗滌固定，于顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲情況，拍照并統(tǒng)計每視野細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行處理，用單因素方差分析進(jìn)行檢驗，分析組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在不同濃度CCL18處理下，E-cadherin隨CCL18濃度增加表達(dá)下調(diào)，而MMP-2、VEGF隨CCL18濃度增加表達(dá)上調(diào)，見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染后各組膀胱癌5637細(xì)胞在顯微鏡下可見：SC組相對于NC組和CC組，細(xì)胞連接變松散，細(xì)胞形態(tài)變的較其他兩組相對較圓。SC組轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞轉(zhuǎn)染率最好，綠色熒光下細(xì)胞比例達(dá)85%，轉(zhuǎn)染率約85%。見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染各組膀胱癌5637細(xì)胞后采用qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：SC組細(xì)胞CCR8、MMP-2、VEGF-C的mRNA表達(dá)水平較CC組均顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而NC組和CC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；SC組細(xì)胞E-cadherin的mRNA表達(dá)水平較CC組上調(diào)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而NC組和CC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染各組膀胱癌5637細(xì)胞后采用western blot檢測結(jié)果顯示：以β-actin作為內(nèi)參，與CC組比較，SC組CCR8、MMP-2、VEGF的蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05）；E-cadherin的蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.05），而NC組CCR8、E-cadherin、MMP-2、VEGF-C的蛋白表達(dá)與CC組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖4。

2.5 轉(zhuǎn)染各組膀胱癌5637細(xì)胞后transwell結(jié)果顯示：與CC組比較，SC組細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而NC組和CC組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖5。

3 討論

CCL18是趨化因子家族中的一員，于1997年被不同研究組發(fā)現(xiàn)，在機體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮了重要的作用[4]，目前有關(guān)炎癥與腫瘤存在相互聯(lián)系的假說已經(jīng)逐步得到多方面證實[5-6]，CCL18誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長、遷移及轉(zhuǎn)移。從實驗來看，CCL18與腫瘤受體情況的關(guān)聯(lián)性不明顯，表明其并未參與腫瘤細(xì)胞受體合成。利用Kaplan-Meier生存分析獲得，CCL18高表達(dá)組具有相對較差的預(yù)后，表明CCL18表達(dá)受乳腺癌生長及轉(zhuǎn)移影響，提示CCL18能應(yīng)用在乳腺癌預(yù)后因素的評估中。CCL18對不同腫瘤相反作用讓大家認(rèn)識到，CCL18調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展機制并不簡單。CCL18對各腫瘤組織，會利用不同的信號通路凸顯不一樣的生物學(xué)功能。而有關(guān)CCL18在腫瘤中異常表達(dá)原因深入探究的實施，不斷構(gòu)建了其上下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，CCL18于腫瘤發(fā)生發(fā)展作用機制將更加明朗，科學(xué)引導(dǎo)CCL18為靶點的分子治療。多種分子中的趨化因子在這些年用在許多體外實驗中。Th1、Th2細(xì)胞能表達(dá)不一樣的趨化因子受體，其參與細(xì)胞募集，同時定位在感染部位，其中CCR8主要作用Th2細(xì)胞，其配體為Ⅰ-309CCR8結(jié)合Ⅰ-309，能阻礙細(xì)胞凋亡。實驗室使用的人膀胱癌5637細(xì)胞，具有較高的干細(xì)胞樣細(xì)胞比例，從細(xì)胞結(jié)果得出，便于提示其在干細(xì)胞中的潛在作用。

有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)：腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）和腫瘤浸潤樹突狀細(xì)胞（TIDCs）分泌的CCL18趨化因子是促進(jìn)肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等癌細(xì)胞浸潤性發(fā)展的重要原因，且初步表明腫瘤轉(zhuǎn)移與相關(guān)趨化因子的濃度有一定相關(guān)性。

膀胱癌多發(fā)于泌尿生殖系統(tǒng)，屬于一種惡性腫瘤。當(dāng)前膀胱癌致病率及致死率于國內(nèi)呈現(xiàn)高發(fā)態(tài)勢，主要致死原因是癌癥侵襲、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重地危害著我國居民健康[7]。文獻(xiàn)[8-10]證實TAMs數(shù)量過多降低了非肌層浸潤性膀胱腫瘤對卡介苗灌注療法的療效，并增加復(fù)發(fā)率；而在肌層浸潤性膀胱腫瘤中，TAMs的數(shù)量顯著性高于非肌層浸潤性腫瘤，顯著增加膀胱癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、血管浸潤的能力，患者5年存活率顯著降低，TIDCs的出現(xiàn)強烈提示處于Ta/T1期的膀胱腫瘤患者將向肌層浸潤性膀胱腫瘤發(fā)展，并影響膀胱腫瘤細(xì)胞對卡介苗灌注療法的敏感性[11]。由此可見，TAMs與TIDCs會促進(jìn)膀胱腫瘤復(fù)發(fā)與浸潤性發(fā)展。CCL18通過結(jié)合腫瘤細(xì)胞的G蛋白偶聯(lián)受體激活多種信號通路促使細(xì)胞骨架重建，同時促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[12]，而EMT會促進(jìn)膀胱癌浸潤性發(fā)展[13]。而CCL18在膀胱癌患者尿液與組織中被發(fā)現(xiàn)有顯著升高[14]。這些均表明CCL18與膀胱癌的浸潤性發(fā)展密切相關(guān)。所以，提升本病認(rèn)識，盡早實施相關(guān)病原學(xué)檢測，有助于及時診治及預(yù)防[15-19]。endprint

通過不同濃度CCL18與膀胱癌細(xì)胞共培養(yǎng)與沉默膀胱癌CCL18受體CCR8后檢測膀胱癌細(xì)胞的生長狀態(tài)、侵襲能力的變化及相關(guān)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，結(jié)果顯示，膀胱癌細(xì)胞的生長及侵襲能力與CCL18濃度呈正相關(guān)，CCL18與膀胱癌細(xì)胞CCR8受體結(jié)合后促進(jìn)了其生長及侵襲。基于超過25%的現(xiàn)有靶向治療藥物的作用靶點是直接或間接作用于G蛋白偶聯(lián)受體，改善預(yù)后[20-21]，因此，該研究有望為膀胱癌的治療提供新的藥物靶點。

參考文獻(xiàn)

[1] Ling Lin，Yong-Song Chen，Yan-Dan Yao，et al.CCL18 from tumor-associated macrophages promotes angiogenesis in breast cancer[J].Cancer Cell，2015，6（33）：34 758-34 773.

[2] Ploenes T，Scholtes B，Krohn A，et al.CC-chemokine ligand 18 induces epithelial to mesenchymal transition in lung cancer A549 cells and elevates the invasive potential[J].PLoS One，2013，8（1）：e53 068.

[3] Yuan R，Chen Y，He X，et al.CCL18 as an independent favorable prognostic biomarker in patients with colorectal cancer[J].J Surg Res，2013，183（1）：163-169.

[4] Vij R，Noth I.Peripheral blood biomarkers in idiopathic pulmonary fi brosis[J].Transl Res，2012，159（4）：218-227.

[5] Kim H S，Ku J H.Systemic Inflammatory Response Based on Neutrophil-to-Lymphocyte Ratio as a Prognostic Marker in Bladder Cancer[J].Disease Markers，2016，2016（3）：

8 345 286.

[6] Mantovani A，Allavena P，Sica A，et al.Cancer-related inflammation[J].Nature，2008，454（7203）：436-444.

[7]王志平，孫王.膀胱腫瘤標(biāo)志物檢測方法的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志，2012，17（3）：319-321.

[8] Ajili F，Kourda N，Darouiche A，et al.Prognostic value of tumor-associated macrophages count in human non-muscle-invasive bladder cancer treated by BCG immunotherapy[J].Ultrastruct Pathol，2013，37（1）：56-61.

[9] Hohman L.Copying Novelties：Carolingian Strategies of Christianization in Sermons[J].European Urology，2014，55（6）：1395-1396.

[10] Ajili F，Kourda N，Darouiche A，et al.Prognostic value of tumor-associated macrophages count in human non-muscle-invasive bladder cancer treated by BCG immunotherapy[J].Ultrastructural Pathology，2013，37（1）：56-61.

[11] Ayari C，LaRue H，Hovington H，et al.High level of mature tumor-infiltrating dendritic cells predicts progression to muscle invasion in bladder cancer[J].Hum Pathol，2013，44（8）：1630-1637.

[12] Wang Y，Wang G，Zhang X，et al.γ-Secretase inhibitor inhibits bladder cancer cell drug resistance and invasion by reducing epithelial-mesenchymal transition[J].Molecular Medicine Reports，2015，12（2）：2821.

[13] Urquidi V，Kim J，Chang M，et al.CCL18 in a multiplex urine-based assay for the detection of bladder cancer[J].PLoS One，2012，7（5）：e37 797.

[14]張國明，韋廣瑩，李踔，等.傳染性單核細(xì)胞增多癥誤診為急性肝炎一例分析及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)[J].現(xiàn)代醫(yī)院，2016，16（9）：1272-1274.

[15]余婧，孫麗.中老年體檢人群CCL18和CEA表達(dá)水平檢測在膀胱癌的應(yīng)用價值[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2017，14（7）：1006-1008.

[16]周肇魁.腫瘤標(biāo)志物糖類抗原125（CA125）、糖類抗原19-9（CA19-9）和癌胚抗原（CEA）在卵巢良惡性腫瘤診斷中的應(yīng)用價值[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，39（17）：170-172.

[17]漆起貴，李正艷，王玉鳳，等.CCL18、IL-6及TNF-α在乳腺癌患者血清中表達(dá)水平關(guān)系的探討[J].重慶醫(yī)學(xué)，2013，42（10）：1095-1096.

[18]劉崢，謝春華，楊基鵬，等.乳腺癌患者血清內(nèi)IL-6和CCL-18表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，16（4）：759-762.

[19]孫平，張洋，張靜.乳腺癌患者血清內(nèi)IL-6和CCL-18的表達(dá)及臨床意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2015，23（8）：1072-1074.

[20]吳雅冬，馮元元.CCL18表達(dá)與卵巢癌預(yù)后的相關(guān)臨床分析[J].實用婦科內(nèi)分泌電子雜志，2016，3（15）：144-145.

[21] OHayre M，Vazquez-Prado J，Kufareva I，et al.The emerging mutational landscape of G proteins and G-protein-coupled receptors in cancer[J].Nat rev Cancer，2013，13（6）：412-424.

（收稿日期：2017-11-15） （本文編輯：程旭然）endprint