程新富　傅斌

【摘要】 目的：探討CCL18與CCR8受體結合對膀胱癌5637細胞增殖和侵襲的影響，為抑制膀胱癌遷移提供實驗基礎。方法：檢測不同濃度CCL18下膀胱癌細胞中EMT部分標志物的蛋白表達變化。通過轉(zhuǎn)染siRNA沉默CCL18的受體CCR8以研究對膀胱癌的生物學行為的影響及產(chǎn)生的相關變化，并進一步觀察細胞形態(tài)、侵襲能力、腫瘤轉(zhuǎn)移的相關變化情況。結果：在不同濃度CCL18處理下，E-cadherin隨CCL18濃度增加其蛋白表達下調(diào)，而MMP-2、VEGF隨CCL18濃度增加其蛋白表達上調(diào)。沉默CCR8受體后檢測膀胱癌細胞連接變松散，細胞形態(tài)相對較圓；CCR8、MMP-2、VEGF-C的mRNA及蛋白表達水平下調(diào)，E-cadherin的mRNA及蛋白表達水平上調(diào)；transwell結果（200倍鏡下）顯示膀胱癌細胞數(shù)顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：CCL18通過結合CCR8受體促進膀胱癌細胞的增殖與侵襲。

【關鍵詞】 膀胱癌； CCL18； CCR8受體； 細胞增殖

Effect of CCL18 Combined with CCR8 Receptor on Proliferation and Invasion of Bladder Cancer Cell Line 5637/CHENG Xinfu，F(xiàn)U Bin.//Medical Innovation of China，2017，14（35）：028-032

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of CCL18 combined with CCR8 receptor on proliferation and invasion of bladder cancer cell line 5637，and to provide an experimental basis for the inhibition of bladder cancer migration.Method：The expression of some EMT markers in bladder cancer cells under different concentrations of CCL18 was detected.Changes by transfection of siRNA silencing CCL18 receptor CCR8 in order to study the biological behavior of bladder cancer and the further observation of cell morphology and invasion related changes，tumor metastasis.Result：At different concentrations of CCL18，the expression of E-cadherin was down regulated with the increase of CCL18 concentration，while the expression of MMP-2 and VEGF was up-regulated with the increase of CCL18 concentration.Loose connection detection of bladder cancer cells after silencing CCR8 receptor，cell morphology was relatively round.mRNA and protein expression of CCR8，MMP-2 and VEGF-C levels were down regulated expression of mRNA and E-cadherin protein level increased.Transwell results（200 magnification） showed that bladder cancer cell number was significantly reduced，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：CCL18 combined with CCR8 receptor can promote the proliferation and invasion of bladder cancer cells.

【Key words】 Bladder cancer； CCL18； CCR8 receptor； Cell proliferation

First-authors address：Jingdezhen Second Peoples Hospital，Jingdezhen 333000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.35.008

腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）和腫瘤浸潤樹突狀細胞（TIDCs）分泌的CCL18趨化因子是促進多種浸潤性發(fā)展的重要原因[1-3]。利用膀胱癌與不同濃度梯度的CCL18與共培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染siRNA以沉默膀胱癌細胞上CCL18的受體CCR8后與CCL18共培養(yǎng)的方法觀察其對腫瘤細胞增殖和侵襲的影響。結合2015年3月-2016年5月CCL18結合CCR8受體對膀胱癌5637細胞增殖和侵襲的影響研究情況，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌5637細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，CCL18重組人蛋白購自美國Perprotech公司，多克隆兔抗人CCR8抗體購自武漢博士德生物公司工程有限公司，CCR8（human）及CCR8 siRNA、Lipo2000和E-cadherin、MMP-2、VEGF-C引物均由invitrogen公司構建合成，Matrigel膠購自BD公司，E-cadherin一抗購自CST公司，MMP-2一抗及VEGF-C一抗購自Anbo公司，RIPA 裂解液購自美國Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國HyClone公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司，TRIzol reagent、DEPC購自invitrogen公司。在PrimerBank中根據(jù)相關引物需要查找相應的引物，選取100～200對堿基對之間的引物送invitrogen公司構建。endprint

1.2 方法

1.2.1 用6孔板接種膀胱癌5637細胞2×105個細胞/孔（約2 mL），培養(yǎng)12 h后。未加CCL18設為對照組（A組）；首先接受20 ng/mL的預處理多克隆兔抗人CCR8抗體4 h，然后50 ng/mL CCL18處理（B組）；接受50 ng/mL CCL18處理為（C組）；接受100 ng/mL CCL18處理為（D組），繼續(xù)培養(yǎng)36 h后。western blot檢測E-cadherin、MMP-2、VEGF-C蛋白表達變化情況。

1.2.2 細胞種板后分組：SC組（即實驗組）轉(zhuǎn)染CCR8 siRNA；NC組（即陰性對照組）轉(zhuǎn)染非特異性脂質(zhì)體；CC組（即空白對照組）未經(jīng)任何處理。實驗各組全部添加50 ng/mL CCL18，做培養(yǎng)處理。經(jīng)過6 h，放置在熒光顯微鏡下，對熒光細胞數(shù)進行觀察，轉(zhuǎn)染效率=（熒光細胞數(shù)/同一視野白光下的細胞總數(shù)）×100%。

1.2.3 收集轉(zhuǎn)染24、48、72 h后以上各組細胞，使用TRIzol試劑及Invitrogen試劑，將總RNA提取出，RNA濃度的測定使用超微量分光光度儀。使用TAKARA試劑盒、qRT-PCR Mix試劑盒進行qRT-PCR反應，以熒光定量PCR儀檢測，各樣品將內(nèi)參照用作β-actin基因（Actin即“肌動蛋白”，屬于細胞重要骨架蛋白），提取且反轉(zhuǎn)錄以上各組細胞的總RNA，生成cDNA，以cDNA作母版，使用2×EasyTaq PCR SuperMix來擴增PCR，循環(huán)40個。PCR以大幅增加微量DNA為最突出表現(xiàn)特征。

1.2.4 取上述各組樣品上樣20 μg，上樣完畢后，用western blot以β-actin為內(nèi)參照分別檢測E-cadherin、MMP-2、MMP-9 、CCR8的蛋白表達量。

1.2.5 Transwell檢測細胞侵襲力的改變，選擇24孔板和與其相稱的侵襲小室，將轉(zhuǎn)染48 h后的細胞加放其中，孵箱培養(yǎng)16 h后洗滌固定，于顯微鏡下觀察細胞侵襲情況，拍照并統(tǒng)計每視野細胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均使用統(tǒng)計學軟件SPSS 20.0進行處理，用單因素方差分析進行檢驗，分析組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 在不同濃度CCL18處理下，E-cadherin隨CCL18濃度增加表達下調(diào)，而MMP-2、VEGF隨CCL18濃度增加表達上調(diào)，見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染后各組膀胱癌5637細胞在顯微鏡下可見：SC組相對于NC組和CC組，細胞連接變松散，細胞形態(tài)變的較其他兩組相對較圓。SC組轉(zhuǎn)染48 h細胞轉(zhuǎn)染率最好，綠色熒光下細胞比例達85%，轉(zhuǎn)染率約85%。見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染各組膀胱癌5637細胞后采用qRT-PCR檢測結果顯示：SC組細胞CCR8、MMP-2、VEGF-C的mRNA表達水平較CC組均顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而NC組和CC組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；SC組細胞E-cadherin的mRNA表達水平較CC組上調(diào)，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而NC組和CC組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染各組膀胱癌5637細胞后采用western blot檢測結果顯示：以β-actin作為內(nèi)參，與CC組比較，SC組CCR8、MMP-2、VEGF的蛋白表達下調(diào)（P<0.05）；E-cadherin的蛋白表達上調(diào)（P<0.05），而NC組CCR8、E-cadherin、MMP-2、VEGF-C的蛋白表達與CC組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖4。

2.5 轉(zhuǎn)染各組膀胱癌5637細胞后transwell結果顯示：與CC組比較，SC組細胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而NC組和CC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖5。

3 討論

CCL18是趨化因子家族中的一員，于1997年被不同研究組發(fā)現(xiàn)，在機體炎癥反應和免疫應答等方面發(fā)揮了重要的作用[4]，目前有關炎癥與腫瘤存在相互聯(lián)系的假說已經(jīng)逐步得到多方面證實[5-6]，CCL18誘導腫瘤細胞生長、遷移及轉(zhuǎn)移。從實驗來看，CCL18與腫瘤受體情況的關聯(lián)性不明顯，表明其并未參與腫瘤細胞受體合成。利用Kaplan-Meier生存分析獲得，CCL18高表達組具有相對較差的預后，表明CCL18表達受乳腺癌生長及轉(zhuǎn)移影響，提示CCL18能應用在乳腺癌預后因素的評估中。CCL18對不同腫瘤相反作用讓大家認識到，CCL18調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展機制并不簡單。CCL18對各腫瘤組織，會利用不同的信號通路凸顯不一樣的生物學功能。而有關CCL18在腫瘤中異常表達原因深入探究的實施，不斷構建了其上下游調(diào)控網(wǎng)絡，CCL18于腫瘤發(fā)生發(fā)展作用機制將更加明朗，科學引導CCL18為靶點的分子治療。多種分子中的趨化因子在這些年用在許多體外實驗中。Th1、Th2細胞能表達不一樣的趨化因子受體，其參與細胞募集，同時定位在感染部位，其中CCR8主要作用Th2細胞，其配體為Ⅰ-309CCR8結合Ⅰ-309，能阻礙細胞凋亡。實驗室使用的人膀胱癌5637細胞，具有較高的干細胞樣細胞比例，從細胞結果得出，便于提示其在干細胞中的潛在作用。

有學者在研究中發(fā)現(xiàn)：腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）和腫瘤浸潤樹突狀細胞（TIDCs）分泌的CCL18趨化因子是促進肺癌、乳腺癌、結腸癌等癌細胞浸潤性發(fā)展的重要原因，且初步表明腫瘤轉(zhuǎn)移與相關趨化因子的濃度有一定相關性。

膀胱癌多發(fā)于泌尿生殖系統(tǒng)，屬于一種惡性腫瘤。當前膀胱癌致病率及致死率于國內(nèi)呈現(xiàn)高發(fā)態(tài)勢，主要致死原因是癌癥侵襲、復發(fā)與轉(zhuǎn)移，嚴重地危害著我國居民健康[7]。文獻[8-10]證實TAMs數(shù)量過多降低了非肌層浸潤性膀胱腫瘤對卡介苗灌注療法的療效，并增加復發(fā)率；而在肌層浸潤性膀胱腫瘤中，TAMs的數(shù)量顯著性高于非肌層浸潤性腫瘤，顯著增加膀胱癌細胞遠處轉(zhuǎn)移、血管浸潤的能力，患者5年存活率顯著降低，TIDCs的出現(xiàn)強烈提示處于Ta/T1期的膀胱腫瘤患者將向肌層浸潤性膀胱腫瘤發(fā)展，并影響膀胱腫瘤細胞對卡介苗灌注療法的敏感性[11]。由此可見，TAMs與TIDCs會促進膀胱腫瘤復發(fā)與浸潤性發(fā)展。CCL18通過結合腫瘤細胞的G蛋白偶聯(lián)受體激活多種信號通路促使細胞骨架重建，同時促進腫瘤細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[12]，而EMT會促進膀胱癌浸潤性發(fā)展[13]。而CCL18在膀胱癌患者尿液與組織中被發(fā)現(xiàn)有顯著升高[14]。這些均表明CCL18與膀胱癌的浸潤性發(fā)展密切相關。所以，提升本病認識，盡早實施相關病原學檢測，有助于及時診治及預防[15-19]。endprint

通過不同濃度CCL18與膀胱癌細胞共培養(yǎng)與沉默膀胱癌CCL18受體CCR8后檢測膀胱癌細胞的生長狀態(tài)、侵襲能力的變化及相關EMT相關標志物的表達，結果顯示，膀胱癌細胞的生長及侵襲能力與CCL18濃度呈正相關，CCL18與膀胱癌細胞CCR8受體結合后促進了其生長及侵襲?；诔^25%的現(xiàn)有靶向治療藥物的作用靶點是直接或間接作用于G蛋白偶聯(lián)受體，改善預后[20-21]，因此，該研究有望為膀胱癌的治療提供新的藥物靶點。

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（收稿日期：2017-11-15） （本文編輯：程旭然）endprint