陳慎，黃穎穎，陸東和，楊成龍*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福州 350003；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350003)

紅曲是以大米作為培養(yǎng)基通過(guò)紅曲菌發(fā)酵制成的一種紫紅色米曲。福建、江蘇、浙江、臺(tái)灣等地區(qū)均為常見(jiàn)產(chǎn)地，其中以福建省為主。目前，紅曲廣泛應(yīng)用于釀酒、食品著色及中藥領(lǐng)域[1]。紅曲發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的天然色素紅曲紅在食品著色領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛，但同時(shí)紅曲紅生產(chǎn)過(guò)程中桔霉素的生成也制約著紅曲色素產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展[2]。法國(guó)Blanc博士在1995年證實(shí)紅曲霉在代謝過(guò)程中具有產(chǎn)生真菌毒素桔霉素(Citrinin)的能力[3]，研究表明桔霉素具有導(dǎo)致腎臟衰竭、損害肝臟代謝及致畸致癌的作用[4-6]。

紅曲的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程在國(guó)內(nèi)已具有相當(dāng)成熟的工藝，并廣泛應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)[7，8]。當(dāng)前對(duì)紅曲產(chǎn)桔霉素的研究主要集中于生產(chǎn)工藝方面[9-13]，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)源起到的因素研究相對(duì)較少。因此研究紅曲桔霉素的代謝過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)源對(duì)發(fā)酵的影響，分析最優(yōu)的營(yíng)養(yǎng)源選擇，調(diào)整液態(tài)發(fā)酵過(guò)程的關(guān)鍵條件以達(dá)到降低桔霉素的目的是當(dāng)前一個(gè)重要的研究方向。

本研究選取本實(shí)驗(yàn)室篩選出的高產(chǎn)桔霉素的菌株L和低產(chǎn)桔霉素的菌株Idu，通過(guò)添加不同碳氮源分析這兩個(gè)菌株產(chǎn)色素及桔霉素的規(guī)律，可為紅曲固態(tài)培養(yǎng)中外加營(yíng)養(yǎng)源的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

采用本實(shí)驗(yàn)室保藏的紅曲霉菌株L和Idu進(jìn)行活化培養(yǎng)和進(jìn)一步試驗(yàn)。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 斜面培養(yǎng)基

將麥芽磨粉后加入10倍的蒸餾水熬煮至10 °Bé的麥芽汁，加入2.5%瓊脂，pH調(diào)至6～7后混合加熱溶解，121 ℃滅菌30 min。

1.1.2.2 液體種子培養(yǎng)基

采用250 mL三角瓶，50 mL蒸餾水中加入6.0%葡萄糖，2.0%胰蛋白胨，0.2% NaNO3，0.2% KH2PO4，0.1% MgSO4，pH自然。并加入數(shù)顆小玻璃珠，121 ℃滅菌30 min后備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅曲霉培養(yǎng)方法

1.2.1.1 斜面種子的制備

選取保藏的純種紅曲霉種子，接種于斜面培養(yǎng)基，于35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)13天，備用。

1.2.1.2 液體種子的制備

培養(yǎng)好的斜面菌種加入無(wú)菌水并用接種環(huán)刮下孢子之后，轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基，接種量2 mL，于32 ℃，150 r/min恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)3天，重復(fù)接種液體培養(yǎng)基1次，培養(yǎng)2天后，取出備用。

1.2.2 碳源對(duì)紅曲菌L、Idu桔霉素含量的影響

在液態(tài)培養(yǎng)基中加入不同碳源作為培養(yǎng)基質(zhì)，考察不同碳源(大米粉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、木糖、木糖醇、甘露醇)對(duì)紅曲菌L、Idu 產(chǎn)桔霉素的影響。

1.2.3 氮源對(duì)紅曲菌L、Idu桔霉素含量的影響

在液態(tài)培養(yǎng)基中加入不同氮源作為培養(yǎng)基質(zhì)，考察不同氮源(硫酸銨、硝酸銨、谷氨酸鈉、酵母膏、蛋白胨)對(duì)紅曲菌L、Idu產(chǎn)桔霉素的影響。

1.2.4 色價(jià)及桔霉素含量的測(cè)定

1.2.4.1 色價(jià)的測(cè)定及計(jì)算方法

胞內(nèi)色價(jià)的測(cè)定：將抽濾的菌絲體于60 ℃烘干至恒重后磨碎，稱取約0.05 g的烘干菌絲體至50 mL比色管中，用70%乙醇溶液稀釋定容至25 mL，在提取溫度60 ℃、提取頻率100 kHz、提取功率300 W的提取條件下超聲波輔助提取15 min，搖勻靜置后稀釋適當(dāng)倍數(shù)(b倍)，以70%乙醇溶液做空白對(duì)照，測(cè)定胞內(nèi)色素的OD值。

胞外色價(jià)的測(cè)定：取1 mL分離菌絲體后的發(fā)酵液，用70%乙醇溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)(a倍)，以70%乙醇溶液做空白對(duì)照，測(cè)定胞外色素的OD值。

總色價(jià)(E)=胞外色價(jià)+胞內(nèi)色價(jià)；胞內(nèi)色價(jià)=(25×b×OD×G1)/G2；胞外色價(jià)=a×OD×V。

注：V為發(fā)酵液總體積；G1為烘干菌絲體總質(zhì)量；G2為烘干菌絲體樣品質(zhì)量。

1.2.4.2 桔霉素的測(cè)定及計(jì)算方法

參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB 5009.222-2016)測(cè)定并計(jì)算桔霉素的含量[14]。

稱取經(jīng)充分粉碎的均質(zhì)試樣1.0 g(精確至0.1 g)于50 mL 具塞錐形瓶中，加入20 mL 甲醇-水(70+30)提取液，以高速均質(zhì)器高速均質(zhì)提取2 min，過(guò)濾提取液，移取1.0 mL濾液，置于另一干凈的容器中，加入39 mL PBS緩沖溶液稀釋、混勻；以玻璃纖濾紙過(guò)濾待免疫親和柱凈化。

將免疫親和柱連接于10 mL玻璃針筒下，準(zhǔn)確移取10.0 mL上述澄清濾液過(guò)免疫親和柱，以1～2滴/s的流速全部通過(guò)親和柱；加入10 mL 0.1%吐溫20-PBS溶液，以1～2滴/s的流速淋洗柱子，直至空氣進(jìn)入到親和柱中，棄去全部流出液。準(zhǔn)確加入1.0 mL甲醇-0.1%磷酸溶液(70+30)進(jìn)行洗脫，洗脫流速為1～2滴/s。收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測(cè)用。

將試樣溶液注入高效液相色譜儀，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，得到試樣溶液中桔青霉素的濃度。

試樣中桔青霉素含量按下式計(jì)算：

式中：X為試樣中桔青霉素的含量(μg/kg)；ρ為樣液中桔青霉素的濃度(μg/L)；V為定容體積(mL)；f為樣液稀釋倍數(shù)；m為樣液所代表的試樣量(g)。計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與分析

2.1 桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制0，1.0，5.0，10.0，50.0 ng/mL 5個(gè)濃度的桔霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。在儀器最佳工作條件下，用桔霉素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣，以相應(yīng)的桔青霉素的色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中桔青霉素的濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Citrinin standard curve

由圖1可知，在1～50 ng/mL的范圍內(nèi)，峰面積與桔霉素質(zhì)量濃度之間線性關(guān)系較好，回歸方程為y=1291.5x+517.22，R2=0.9991。

2.2 碳氮源對(duì)所選菌株產(chǎn)物的影響特性研究

2.2.1 各種碳源對(duì)菌株L、Idu產(chǎn)色素及桔霉素的影響研究

在紅曲菌L的液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，不同種類碳源對(duì)色素與桔霉素產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同碳源對(duì)菌株L色素與桔霉素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on the yield of L pigment and citrinin in strain

由圖2可知，葡萄糖、麥芽糖、甘露醇作為碳源時(shí)色素產(chǎn)量都較高，分別達(dá)到了218.40，206.52，145.08 U/mL，相對(duì)應(yīng)的桔霉素產(chǎn)量依次為75.24，69.32，68.4 mg/mL。大米粉作為碳源的菌株發(fā)酵后色價(jià)可達(dá)到72.02 U/mL，同時(shí)桔霉素含量最低，僅為1.74 mg/L。綜合色價(jià)與桔霉素產(chǎn)量來(lái)看，大米粉作為常規(guī)碳源其色價(jià)與桔霉素的比值最高，在實(shí)際生產(chǎn)中的意義較大，適宜在產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中使用。

在紅曲菌Idu的液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，不同種類碳源對(duì)色素與桔霉素產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同碳源對(duì)菌株Idu色素與桔霉素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of different carbon sources on the yield of Idu pigment and citrinin in strain

與菌株L相比，菌株Idu產(chǎn)色素的能力較低，同時(shí)產(chǎn)桔霉素的能力也顯著降低。不同培養(yǎng)基中，麥芽糖作為碳源的發(fā)酵液色價(jià)最高，為56.94 U/mL，其余依次為葡萄糖、蔗糖、木糖、大米粉與甘露醇。桔霉素產(chǎn)量最大的碳源為蔗糖，其產(chǎn)量可達(dá)2.91 mg/L，最低的碳源為大米粉，桔霉素含量為0.6 mg/L。在選用的所有7種碳源中，6種碳源發(fā)酵產(chǎn)物的桔霉素含量均低于1 mg/L。由此可知，不同碳源對(duì)菌株Idu的色素產(chǎn)量具有顯著影響，但對(duì)桔霉素的產(chǎn)量影響不大。

2.2.2 各種氮源對(duì)菌株產(chǎn)色素及桔霉素的影響研究

在紅曲菌L的液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，不同種類氮源對(duì)色素與桔霉素產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同氮源對(duì)菌株L色素與桔霉素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of different nitrogen sources on the yield of L pigment and citrinin in strain

由圖4可知，不同氮源對(duì)菌株L的產(chǎn)色能力和產(chǎn)桔霉素能力均具有一定的促進(jìn)作用，其中谷氨酸鈉對(duì)該菌株的兩種代謝產(chǎn)物促進(jìn)能力最強(qiáng)，色素含量可達(dá)63.96 U/mL，桔霉素含量可達(dá)8.13 mg/L。硝酸銨、酵母膏、硫酸銨對(duì)菌株L產(chǎn)色能力和產(chǎn)桔霉素能力的促進(jìn)作用均不及谷氨酸鈉，發(fā)酵液色價(jià)均為24 U/mL左右，桔霉素含量為1 mg/L左右。綜合不同氮源的色素與桔霉素產(chǎn)出之比，谷氨酸鈉在作為氮源時(shí)，菌株L的發(fā)酵液色價(jià)最高，同時(shí)桔霉素含量在較為可控的范圍內(nèi)，因此選擇谷氨酸鈉作為該菌株的最優(yōu)氮源。

在紅曲菌Idu的液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，不同種類氮源對(duì)色素與桔霉素產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同氮源對(duì)菌株Idu色素及桔霉素產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on the yield of Idu pigment and citrinin in strain

由圖5可知，該液態(tài)發(fā)酵過(guò)程與菌株L相似，谷氨酸鈉對(duì)菌株Idu產(chǎn)2種代謝產(chǎn)物促進(jìn)能力最強(qiáng)，色素含量最高可達(dá)48.86 U/mL，但桔霉素的含量達(dá)到19.59 mg/L，而酵母膏、硝酸銨、硫酸銨對(duì)該菌株的產(chǎn)色素促進(jìn)能力依次降低，對(duì)應(yīng)的桔霉素含量也依次降低。與菌株L相同，谷氨酸鈉作為氮源時(shí)，色素產(chǎn)量和桔霉素產(chǎn)量均有提高，但谷氨酸鈉對(duì)Idu菌株的產(chǎn)桔霉素能力促進(jìn)作用明顯高于菌株L，因此采用Idu作為生產(chǎn)菌株時(shí)需慎重選擇氮源。

3 結(jié)論

在高產(chǎn)桔霉素紅曲菌株L的發(fā)酵過(guò)程中，碳源對(duì)該菌株的產(chǎn)色素能力和產(chǎn)桔霉素能力都有顯著影響，選取的4種碳源均具有顯著的促進(jìn)作用，但僅僅以大米粉作為碳源時(shí)，桔霉素產(chǎn)量最少。因此大米粉作為常規(guī)碳源其色價(jià)與桔霉素的比值最高，在實(shí)際生產(chǎn)中的意義較大；而在氮源的選取上，選取4種氮源對(duì)菌株L的產(chǎn)色能力和產(chǎn)桔霉素能力也同樣具有促進(jìn)作用，其中谷氨酸鈉對(duì)該菌株的2種代謝產(chǎn)物促進(jìn)能力最強(qiáng)，綜合不同氮源的色素與桔霉素產(chǎn)出之比，選取谷氨酸作為該菌種的氮源較為合適。

在低產(chǎn)桔霉素菌株Idu的發(fā)酵過(guò)程中，麥芽糖作為碳源的發(fā)酵液色價(jià)最高，其余依次為葡萄糖、蔗糖、木糖、大米粉與甘露醇。蔗糖作為碳源時(shí)桔霉素的產(chǎn)量最高，大米粉最低。在選取的所有7種碳源中，6種碳源發(fā)酵產(chǎn)物的桔霉素含量均低于1 mg/L，因此整體而言，碳源對(duì)Idu菌株的桔霉素產(chǎn)量影響不大，選取促色素產(chǎn)量最高的麥芽糖較為合理；在氮源的選取上，由于桔霉素的產(chǎn)量隨著菌種產(chǎn)色能力的增加而增加，因此選取產(chǎn)桔霉素最少的硫酸銨作為氮源以避免發(fā)酵產(chǎn)品桔霉素的超標(biāo)。

紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物紅曲色素與桔霉素同屬于聚酮化合物，2種產(chǎn)物合成受聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)的催化。在聚酮體合成的過(guò)程中，一分子乙酰輔酶A(acetyl coenzyme A，acetyl-CoA)單位與3個(gè)或者多個(gè)丙二單酰輔酶A(malonyl coenzyme A，malonyl-CoA)通過(guò)脫羧縮合、甲基化形成四酮體(tetraketide)，隨后2天不同的代謝途徑分別轉(zhuǎn)化為桔霉素和色素。

當(dāng)前研究并沒(méi)有很好地闡述該2種途徑的影響因素，碳氮源對(duì)不同菌種生成次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響過(guò)程可能是由于不同的營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)合成酶系活性的變化產(chǎn)生了作用，因此還需進(jìn)一步的研究分析來(lái)確定紅曲霉代謝的關(guān)鍵影響因素。

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