唐 功，何 敏，王仕英，嬴 河，鄭貴鳳，沙馬爾的木，李毛卓改

（阿壩師范學院，化學化工與生命科學系，四川 汶川縣水磨鎮(zhèn)623003）

果膠酶法提取紫甘藍花青素工藝條件研究

唐 功，何 敏，王仕英，嬴 河，鄭貴鳳，沙馬爾的木，李毛卓改

（阿壩師范學院，化學化工與生命科學系，四川 汶川縣水磨鎮(zhèn)623003）

文章探索了果膠酶法提取紫甘藍花青素的工藝條件.采用單因素試驗和正交試驗相結合的方法研究不同因素即pH值、酶解溫度、酶解時間、酶量和料液比對花青素提取的影響.最佳提取條件是：加酶量0.7%、pH＝4、酶解時間是60min、料液比1︰10、酶解溫度40℃.果膠酶法提取紫甘藍花青素的色價是普通乙醇溶劑法提取的15倍，這為花青素提取技術的研究提供理論參數(shù)支持.

果膠酶；花青素；提取工藝

紫甘藍俗稱紫包菜，是結球甘藍中的一個變種.它的葉片呈紫紅色，表面有灰白色蠟粉，其中富含花青素，雖然它不是人體必需的營養(yǎng)素，但確是最常見的抗氧化物質之一［1］，對于預防衰老和相關的疾病很有幫助.各國學者對不同來源的植物原花青素進行研究，發(fā)現(xiàn)紫甘藍中的花青素具有預防心臟疾?。?］、心血管疾?。?］、抗氧化［4］等功能，將其開發(fā)利用有可能成為一種有價值的天然色素資源.

目前，研究紫甘藍花青素提取工藝的文獻不多，大多采用傳統(tǒng)的浸提法［5－6］、微波輻射法和超聲波輔助法［7］.但是在天然食用色素提取中，由于天然色素一般在高溫、強酸、強堿條件下發(fā)生變化或分解，而酶輔助提取技術具有專一性強、條件溫和、反應過程容易控制［8］等眾多優(yōu)勢，所以酶解法更適合于天然食用色素的提取.本試驗主要研究的是果膠酶法提取紫甘藍花青素最佳條件，包括pH值、加酶量、酶解溫度、酶解時間和料液比，為紫甘藍花青素提取技術的研究提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘藍：汶川縣水磨鎮(zhèn)農貿市場購買；試劑：果膠酶10u／mg，購于成都市科龍化工試劑廠；鹽酸、無水乙醇（均為分析純）.

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計、恒溫水浴鍋、電熱恒溫干燥箱、筆式酸度計、電子天平、離心機.

1.3 方法

1.3.1 紫甘藍花青素提取液的制備

將購于市場的紫甘藍放入80℃的恒溫箱中進行24小時烘干→粉碎→加入提取液→調節(jié)pH值→加入果膠酶，電動攪拌輔助酶解60min→酶解液4 000r／min離心30min后抽濾取上清液→花青素提取液.

1.3.2 單因素試驗

稱取一定質量的紫甘藍粉末于三角瓶內，調節(jié)pH值后加入果膠酶，放入水浴鍋中.在一定溫度下攪拌一段時間后加入乙醇浸提，然后將瓶內溶液以4 000r／min轉速離心30min，取部分所得上清液，在530nm處測定其吸光度，進而計算花青素色價.分別考察pH值、酶解溫度、加酶量、底物濃度、酶解時間對紫甘藍花青素提取效率的影響.

1.3.3 紫甘藍花青素含量的檢測

空白對照的制備：相應體積的蒸餾水.

參照楊朝霞［9］的色價測定方法，以上述空白樣做空白對照，在波長530nm下對花青素溶液進行吸光度檢測，并計算色價.

色價表達式為：E1cm1%＝（A／W）×K.

式中：E1cm1%為色價；A為吸光度；W為樣品質量／g；K為稀釋倍數(shù).

1.3.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用L16（45）正交試驗優(yōu)化提取條件，因素和水平見表1.

表1 果膠酶提取條件正交水平表

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

固定條件為酶解pH＝4，酶解溫度為40℃，加酶量0.7%，料液比為1︰10，酶解時間60min.在其他條件不變的情況下分別考察酶解pH值、酶解溫度、加酶量、料液比、酶解時間對花青素提取效率的影響，根據(jù)花青素提取液的色價大小確定最佳提取條件.

2.1.1 pH值對花青素色價的影響

酶解pH值梯度設置為4.0、5.0、6.0、7.0，酶解后測其分光光度值，并計算色價.根據(jù)色價大小確定最佳酶解pH值，結果如圖1所示.

圖1 pH對酶解提取紫甘藍花青素色價的影響

由圖1可知，紫甘藍花青素溶液色價隨pH值增大而減小.在pH＝4時有最大的值，因此pH值的升高不利于酶解提取紫甘藍花青素.pH值對酶解助提取效率影響主要體現(xiàn)在兩個方面：一方面是pH值的大小影響紫甘藍花青素在水中的溶解度；另一方面是pH值的大小影響果膠酶酶解紫甘藍細胞壁，從而影響花色苷的流出.

綜上所得，在pH＝4時花青素色價最大，此時為最佳提取的pH值.

2.1.2 酶解溫度對花青素色價的影響

將酶解溫度梯度設置為20℃、30℃、40℃、50℃，酶解后測其分光光度值，并計算色價，根據(jù)色價大小來確定最適酶解溫度，結果如圖2.

圖2 酶解溫度對酶解提取紫甘藍花青素色價的影響

由圖2知，從總體趨勢來看，紫甘藍花青素色價在一定范圍內隨溫度的升高而升高，直到酶的活性達到最大，但超過40℃時色價隨溫度的升高反而降低.因為酶的活性不但不會升高反而會下降，最后導致酶失活.由圖2可知，溫度40℃為提取的最適溫度.

2.1.3 加酶量對花青素色價的影響

將加酶量的梯度設置為0.2%、0.7%、1.2%、1.7%，酶解后測其分光光度值，并計算色價，根據(jù)色價大小來確定最佳加酶量，結果如圖3.

圖3 加酶量對酶解提取紫甘藍花青素色價的影響

由圖3可知，隨著酶量的增加色價不斷增大，當酶量達到0.70%后色價增大不明顯.但當酶解到一定程度時，隨著酶量增大，紫甘藍的細胞壁破壞就越厲害，也就越不利于花青素的提取，因此確定最佳的加酶量為0.70%.

2.1.4 料液比對花青素色價的影響

將料液比的梯度設置為1︰5、1︰10、1︰15、1︰20，酶解后測其分光光度值，并計算色價，根據(jù)色價來確定最佳料液比，結果如圖4.

圖4 料液比對酶解提取紫甘藍花青素色價的影響

由圖4可知，料液比在1︰10時色價最高，之后隨著料液比的增加花青素的色價反而下降.這表明提取劑的增加不利于酶解提取花青素，根據(jù)實驗結果確定酶解料液比為1︰10.

2.1.5 酶解時間對花青素色價的影響

將酶解時間梯度設置為30min、60min、90min、120min，酶解后測其分光光度值，再計算色價，根據(jù)色價大小來確定最佳酶解時間，結果如圖5.

圖5 酶解時間對酶解提取紫甘藍花青素色價的影響

由圖5可知，在60min的時候色價是最高的.隨著酶解時間的延長，花青素色價呈現(xiàn)下降趨勢.因為時間過長，酶解反應逐漸結束，所以色價降低.由圖5可知，在提取時間為60min時色價最高，可以確定為最佳酶解提取時間.

表2 果膠酶助提取條件正交試驗結果

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上進行正交試驗.根據(jù)表1設置的條件進行酶解提取，表2為果膠酶助提取條件正交試驗結果.

根據(jù)表2判斷，5個因素對紫甘藍花青素色價的影響順序為：C＞A＞E＞D＞B，最優(yōu)提取條件為A1B3C2D2E2，即酶解提取pH＝4、酶解溫度為40℃、加酶量為0.7%、料液比為1︰10、酶解時間為60min.

通過SPSS13.0對正交試驗結果進行方差分析，結果如表3.

表3 正交試驗方差分析

由表3可見，5因素中對試驗有顯著影響的是加酶量和pH值，較為顯著影響的是酶解時間、料液比，不顯著的是酶解溫度.影響順序與表2相同，即最佳提取工藝為A1B3C2D2E2.

2.3 酶法提取花青素的驗證試驗

果膠酶優(yōu)化提取與同條件乙醇溶劑法提取結果比較：在相同條件下（pH值為4、料液比為1︰10、提取溫度為40℃、提取時間為60min）分別在果膠酶酶解和乙醇溶劑中進行試驗，做2次驗證試驗，在530nm處測取吸光度并計算出花青素的色價，結果如表4.

表4 驗證試驗結果

由表3可見，酶解法提取的色價是溶劑法提取的15倍.因此，用果膠酶法提取紫甘藍的花青素可以減少溶劑污染，同時可提高提取效率，同傳統(tǒng)溶劑法相比能夠節(jié)約資源，實現(xiàn)工業(yè)化的可行性.

3 結論

單因素試驗與正交試驗結果表明，果膠酶法提取紫甘藍中花青素的最佳工藝條件為加酶量0.7%、pH＝4的酸性乙醇、酶解時間是60min、料液比1︰10、酶解溫度是40℃.果膠酶法提取紫甘藍花青素色價是溶劑法提取的15倍.通過對比試驗證明，酶解法提取紫甘藍花青素既可以減少溶劑污染，同時又提高了提取的效率，它為紫甘藍花青素的提取提供了一條新途徑，對工業(yè)化生產具有一定的參考價值，為紫甘藍色素的開發(fā)利用提供了參考.

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［9］楊朝霞.紫甘薯花色苷色素提取純化工藝研究及組分分析［D］.青島：青島大學，2004.

Study on Extraction Conditions of Pectinase Anthocyanins of Purple Cabbage

TANG Gong，HE Min，WANG Shi－ying，YIN He，ZHENG Gui-feng，SHA Ma-er-di-mu，LI Mao-zhuo-gai
（Department of Chemistry and Life Science，Aba Normal University，Wenchuan 623002，China）

Objective The present study aimed to explore the extraction of purple cabbage anthocyanin with a pectinase method.Methods The single factor test and orthogonal test were used to study the effects of different factors，namely pH value，temperature，time，pectinase amount and solid-liquid ratio on the extraction of anthocyanins.Results The optimal extraction conditions included 0.7%pectinase，pH＝4，enzymatic hydrolysis time of 60minutes，1：10solid-liquid ratio，the enzyme hydrolysis at 40℃temperature.Conclusion The color value of purple cabbage anthocyanin with pectinase extraction was 15times mire than that of the ordinary extraction with ethanol solvent method.Our results probably provided some theoretical and experimental support for the extraction technology of anthocyanins.

Pectinase；Anthocyanin；Extraction technology；

TQ461

A

1009-2102（2016）03-0001-06

2016－08－02

四川中小學教師專業(yè)發(fā)展研究中心（TDTR2016－015），校級教改課題（重點）（JXGG2015－03）.

唐功（1970—），男，甘肅定西人，碩士，副教授，主要從事生物化學教學與研究.